190836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására
1 190 836 2 tion of lipoproteins in normal and diseased states; Blood Lipids and Lipoproteins: Quantitation, Composition and Metabolism. Kiadó: Nelson, Wiley, New York, 1972, 471-583. old.]. A frakciót végül még két sűrűségnél, 1,080-nál és 1,210-nél 5 * * * * ülepítjük, illetve dotáljuk. A HDL-frakciót immobilizált konkanavalin A-n affinitás-kromatográfiásan [FEBS Lett. 91, 174-198 (1974)] vagy R. W. Mahley és K. S. Holcombe [J. Lipid. Res. 18, 314-324 (1977)] szerint 10 * * * 14 Geon-Pevicon blokkelektroforézissel elektroforétikusan tisztítjuk. B) Az antiszérum előállítása. Állatfaj: birka vagy nyúl. Az A) pont szerint kapott immunogén alkalma- 15 zásával a következő immunizálási vázlatot használjuk : Nap Alkalmazás Immunogén-mennyi- 2Q r SPOT 1 mg protein (HDL) emutgeálva Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) 25 emulgeálva Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva Freund adjuvánsban 30 1 mg protein (HDL) emulgeálva Freund adjuvánsban I mg protein (HDL) emulgeálva 35 Freund adjuvánsban 1 mg protein (HDL) emulgeálva Freund adjuvánsban 40 Az első próbavéreztetést 45 nap múlva végezzük. 14 nap elteltével újból vért veszünk és az ebből nyert szérumot HDL-antitestre vizsgáljuk turbidimetriásan, HDL-lel, mint antigénnel. Azokat a szé- 4g rumokat, amelyek elegendő HDL-antitestet tartalmaznak, összegyűjtjük. Ezt a „szérum-poolt” közvetlenül alkalmazzuk HDL-antiszérumként vagy D. M. Weir, lmmunochemistry Vol. 1., Kap. 6. Blackwell Scient. Publ. 173 szerint tisztított anti- 50 test-frakcióvá tisztítjuk és az 5. példa szerint felhasználjuk. C) 50 pl szérumot elegyítünk 150 pl B) pont szerint előállított antiszérummal. Szobahőmérsékleten 30 percig tartó inkubálás után a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 g-nál). 50 pl tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml reagenssel elegyítünk, amely 0,1 mól/liter trisz-puffert (pH = 7 ,7), 0,05 mól/liter magnézium-aszpartátot, 1 mmól/liter 4ramino-fenazont [2,3-dimetil-4- (dimetil-amino)-l-fenil-3-pirazolin-5-on], 6 mmól/ liter fenolt, 4 mmól/liter 3,4-diklór-fenolt, 0,3% zsíralkohol-poliglikol-étert, 400 E/Iiter koleszterinészterázt, 250 E/liter koleszterinoxidázt és 200 E/liter peroxidázt tartalmaz. 0 intradermálisan 7 intramuszkulárisan 14 bőr alá 30 intramuszkulárisan 60 bőr alá minden további 30 nap bőr alá Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után 546 nm-nél mérjük a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben (a reagens-vakérték 50 pl antiszérumot tartalmaz, és az antiszérum koleszterin-tartalmát veszi figyelembe). ~ ^^minu gén»-va kérték LDL-koleszterin (mg/dl) = 1,385 x AE Szé-Ki nézés Koleszterin Trigliccri-LDL-koleszterin rum dek N1H-immunolóeljárás* giai lecsapás 1 zavaros 353 mg/dl 503 mg/dl 234 mg/dl 238 mg/dl 2 tiszta 638 mg/dl 59! mg/dl 510 mg/dl 495 mg/dl 3 tiszta 350 mg/dl 153 mg/dl 237 mg/dl 231 mg/dl 4 zavaros 195 mg/dl 575 mg/dl 102 mg/dl 95 mg/dl 5 chylomikronokat tártál-231 mg/dl 379 mg/dl 149 mg/dl 130 mg/dl máz •Referenciamódszerként az NIH-eljárás szolgál. (VLDL és chylomikronok ultracentrifugában való leválasztása után LDL-t csapunk le. A lecsapás előtti és utáni koleszterinérték különbségéből kapjuk az LDL-koleszterinértéket.) Manual of Laboratory Operations, Lipid Research Clinics Program, Lipid and Lipoprotein Analysis, DHEW Publication No. 65-628. 2. példa 50-50 pl VLDL, HDL, LDL, illetve chylomikron oldatot elegyítünk 150 pl nyúl-antiszérummal, amelyet immunogénként HDL-t alkalmazva állítottunk elő. Centrifugálás után a koleszterin-tartalmat az 1. példában leírtak szerint határozzuk meg a felülúszóban. Minta A minta koleszterin-tartalma lecsapás előtt lecsapás után Chylomik-61,4 mg/dl 2,6 mg/dl ronok VLDL 23,2 mg/dl 2,8 mg/dl LDL 177,0 mg/dl 165,0 mg/dl HDL 50,9 mg/dl 0,0 mg/dl 3. példa Módszer LDL-foszfolipidek meghatározására 50 pl szérumot 150 pl, az 1 példa B) pontja szerint előállított antiszérummal elegyítünk. Szobahőmérsékletű 30 perces inkubálás után a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 gnál). 50 pl tiszta csapadék feletti felülúszót 3 ml olyan reagenssel elegyítünk, amely 50 mmól liter triszpuffert (pH = 8,0), 20 mmól/liter fenolt, X mmól/ liter 4-amino-fenazont, 1000 E/liter fos/lólipidáz D-i. 1400 E/liter kolinoxidázt és 800 E/liler peroxidázt tartalmaz. Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után 4
