190836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens low density lipoproteinek meghatározására
1 190 836 2 a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben méljük (a reagens-vakérték 50 ni antiszérumot tartalmaz, amely 3 + 1 arányban fiziológiás nátrium-kloridoldattal hígított és figyelembe veszi az antiszérum foszfolipid-tartalmát a csapadék feletti felülúszóban). 5 A kiértékelést kolin-klorid-sztandardon keresztül végezzük (54,1 mg/100 ml, ez megfelel 300 mg foszfolipid/100 ml mennyiségnek), amit,’ ugyanúgy, mint a szérumot, 1 + 3 arányban elegyítünk az antiszérummal. 10 AEj AErnintÄ ^^reageiw-víkfcrtck AE2 ^^«ztandard ^^reagem-vakértélc AF LDL-foszfolipid (mg/100 ml) = 300 x Afc2 15 4. példa Módszer LDL-trigliceridek meghatározására 2o 50 pl szérumot 150 pl az 1. példa B) pontja szerint előállított antiszérummal elegyítünk. Szobahőmérsékleten 30 percig tartó inkubálás után a keletkezett csapadékot lecentrifugáljuk (2 perc 10 000 g-nál). 50 pl tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml olyan 2g reagenssel elegyítünk, amely 0,15 mól/liter triszpuffert (pH = 7,6), 17,5 mmól/liter magnézium-szulfátot, 10 mmól/liter EDTA-dinátrium-sót, 3,5 mmól/ liter 4-klór-fenolt, 0,15% nátrium kolátot, 6 mmól kálium-[hexaciano-ferrát(II)]-ot, 0,12% detergenst, ,0 0,5 mmól/liter ATP-t, 0,35 mmól/liter 4-amino-fenazont, 3000 E/liter észterázt, 2500 E/liter glicerin-foszfatooxidázt, 200 E/liter glicerokinázt és 150 E/liter peroxidázt tartalmaz. 37 °C-on 10 percig tartó inkubálás után mérjük a minta extinkcióját a reagens-vakértékkel szemben (a J reagens vakérték 50 pl antiszérumot tartalmaz, amely 3 +1 arányban fiziológiás nátrium-klorid-oldattal hígított és figyelembe veszi az antiszérum trigliceridtartalmát). A kiértékelést glicerin-sztandardon keresztül végezzük, amely 200 mg/dl triglicerid-tartalomnak felel meg és amely, ugyanúgy mint a szénun, 1 + 3 arányban antiszérummal van elegyítve. AEj AEm-nta ^^reagens-vakcrtck AE2 ^^sztandard ^^reagens-vakérték 45 LDL-triglicerid (mg/100 ml) = 200 x 5. példa 50 50-50 pl VLDL-t, HDL-t, LDL-t, illetve chylomikronokat tartalmazó oldatot különböző mennyiségű tisztított HDL-antitesttel (nyúl eredetű) elegyítünk. Centrifugálás után a felülúszóban az 1. példában meg- 55 adottak szerint meghatározzuk a koleszterin-tartalmat. 60 65 Reagens A minta koleszterin-tartalma mg/dl lecsapás előtt lecsapás után a) HDL-antitest-koncentráció 10 3 mól/liter Chylomikronok 61,4 2,4 VLDL 23,2 2,8 LDL 177,0 165,0 HDL 50,9 0,0 b) HDL-antitest-koncentráció 10~5 mól/liter Chylomikronok 61,1 2,5 VLDL 23,0 2,9 LDL 177,5 166,0 HDL 51,2 0,0 c) HCL-antitest-koncentráció 10-7 mól/liter Chylomikronok 61,6 2,7 VLDL 23,6 2,6 LDL 177,1 167,0 HDL 50,5 0,0 6. példa a) immobilizált antitest előállítása 10 ml, emberi HDL elleni birka-antiszérumból származó IgG-frakciót (protein-tartalom összesen 280 mg/15 mmól/liter - 50 mmól/liter nátrium-kloridot tartalmazó - kálium-foszfát-pufferben „Affinitätsadsorbens, Glutardialdehyd-aktiviert” (Boehringer Mannheim, Kat. sz. : 665 526) adszorbensen megkötünk, a gyártó útmutatásai szerint. Ily módon 1 g adszorbensen 10-15 mg IgG-t immobilizálunk. A megkötési kapacitás LDL-re körülbelül 20 mg/ adszorbens g. b) LDL-teszt immobilizált antitesttel 50 pl szérumot 250 pl fiziológiás konyhasóoldattal hígítunk és összekeverünk az immobilizált antitest nedves pasztájának 300 pl mennyiségével, majd 60 percig rázzuk < 25 *C-on. Ezt követően 2 percig centrifugáljuk 10 000 g-nál. 50 pl tiszta csapadék feletti felülúszót 2 ml olyan reagenssel elegyítünk, amely 0,1 mól/liter trisz-puffert (pH = 7,7), 0,05 mól/liter magnézium-aszpartátot, 1 mmól/liter 4-amino-fenazont, 6 mmól/liter fenolt, 4 mmól/liter 3,4-diklór-fenolt, 0,3% zsíralkohol-poliglikol-étert, 400 E/liter peroxidázt tartalmaz. . Szobahőmérsékleten 20 percig tartó inkubálás után mérjük a minta extinkcióját 546 nm-nél, reagensvakértékkel szemben (a reagens-vakérték 50 pl antiszérumot tartalmaz és figyelembe veszi az antiszérum koleszterin-tartalmát). A kiértékelést olyan extinkciós érték alapján végezzük, amit azonosan kezelt szabad koleszterin-sztandarddal kaptunk, az alábbi képlet alapján: c ■ = AE„-AE sztandard ‘-'sztaixiard A NIH-eljárással végzett összehasonlítás jó egyezést adott: 5
