190814. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új poliéter típusú antibiotikumok előállítására
1 . 190 814 2 átoltásokkal fenntartható vagy a jól kifejlett tenyészetből vett, miléciumot tartalmazó agar darabbal folyékony táptalajt olthatunk be. Actinomadura yumaense rázott tenyészet készítésére 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril folyékony táptalajt ferdeagar tenyészetről belekapart vagy belemosott spórákkal oltunk be és inokulálunk. A következőkben az erre a célra alkalmas folyékony táptalajokra adunk példákat : A Táptalaj Marhahúskivonat 0,3% Bacto® tryptone1 0,5% Glukóz 1,0% Élesztőkivonat 0,5% Víz kiegészítésűi 100%-ra '. A Difco Laboratories (Detroit, Michigan) lajstromozott védjeggyel bíró pepton készítménye. A táptalaj pH-ját híg bázissal, például nátriumhidroxiddal 6,8-7,2 értékre állítjuk be. B Táptalaj Glükóz 1 % Keményítő 2% Élesztőkivonat 0,5% N-Z Amine A®2 0,5% Kalcium-karbonát 0,1 % Víz kiegészítésül 100%-ra 2. A Sheffield Chemical Co. (Div. Nat’l. Dairy Products Corp., Norwich, N. Y.) lajstromozott védjeggyel bíró emésztett kazein készítménye. Az előbbiekben ismertetett két táptalaj közül a B táptalaj az előnyösebb. A lombikokat 1-4 napon át 25-35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten inkubáljuk és rotációs rázógépen erősen rázatjuk. Ezt a tenyészetet használjuk fermentációs tenyészet inokulumaként vagy lefagyasztva tároljuk és későbbi törzstenyészet inokulumaként alkalmazzuk. A következőkben példákat adunk azokra a táptalajokra, melyet az Actinomadura yumaense LLC23 024a, ß és v antibiotikumot termelő fermentációk táptalajául szolgálhatnak. C Táptalaj Glükóz 1,5% Glicerin 1,5% Szójaliszt3 1,5% Kalcium-karbonát 0,1% Nátrium-klorid 0,3% Víz kiegészítésül 100%-ra 3. Azonos eredmény elérése mellett helyettesíthegyapotmagliszttel vagy húskivonattal. D Táptalaj Glükóz 3% Szójaliszt 1,5% Kalcium-karbonát 0,1% Nátrium-klorid 0,3% Víz kiegészítésül 100%-ra E Táptalaj Keményítő 1% Melasz 2% Szójaliszt 1,5% Kalcium-karbonát 0,1% Víz kiegészítésül 100%-ra F Táptalaj Glükóz 3% Húskivonat 2,5% Nátrium-klorid 0,2% Kalcium-karbonát 0,1 % Víz kiegészítésül 100%-ra G Táptalaj Glükóz 3% Szójaliszt 0,5% Ammónium-szulfát 0,3% Nátrium-klorid 0,2% Kalcium-karbonát 0,1% Víz kiegészítésül 100%-ra H Táptalaj Glükóz 3 % Ammónium-szulfát 0,3% Dikálium-hidrogén-foszfát 0,1% Kalcium-karbonát 0,2% Nátrium-klorid 0,1% Víz kiegészítésül 100%-ra A C-H táptalajok közül a D táptalaj a legelőnyösebb. A fermentáció úgy is kivitelezhető, hogy 500 mles lombikban lévő 100 ml táptalajt 3-10 térf.% előzőekben leírt módon készített törzstenyészettel oltunk be és 25-35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten 24-72 órán át levegőztetve inkubáljuk. A fermentációs tenyészetből vett minták lefagyasztva tárolhatók és a későbbiekben törzstenyészethez inokulumként használhatók. Ugyancsak elvégezhető a fermentáció levegőztetést és keverést biztosító szerelvényekkel ellátott nagyobb méretű fermentorokban is. Egy-egy fermentort 3-10 térf.% az előzőekben leírt módon készített inokulummal oltunk be. A levegőztetés mértékét 0,5-2,0 1 steril levegő/liter táptalaj/perc értéken tartjuk és a fermentlevet 200-400 fordulat/perc fordulatszámú keverővei keverjük. A hőmérsékletet 25—35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten tartjuk. A fermentációt az antibiotikum táptalajban való felgyülemléséig, általában 100-150 órán át folytatjuk, majd az antibiotikumot kinyerjük. Az antibiotikum kinyerését és tisztítását a 4 278 663 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megadott eljárással végezzük, vagy a következőkben ismertetésre kerülő megoldás izennt járunk el. Az előzőekben ismertetett eljárással előállított, teljes sejteket tartalmazó nyers fermentlevelet azonos térfogatú nem szénhidrogén típusú, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel keverjük össze. Előnyösek a metilén-klorid és az etil-acetát. A szerves fázist elválasztjuk és vákuumban olajosra pároljuk. A kapott olajat metilén-kloridban oldjuk és szilikagel-, alumínium-, Sephadex LH-20-R (Pharmacia Inc., Pharmacia Fine Chemicals Div., Piscataway, N. Y.) vagy magnézium-alumínium-szilikát oszlopra visszük. Az oszlop elválására alkalmas oldószerek például a dietil-éter, az etil-acetát, metilénklorid, etil-éter (1 : 1)—(1 : 7) térfogat arányú elegye, 10-40% acetont tartalmazó metilén-klorid, 2-10% rövidszénláncú alkoholt, előnyösen metanolt, tartalmazó metilén-klorid, 2-15% acetonitrilt tartalmazó metilén-klorid vagy 2-15% dioxánt tartalmazó metilén-klorid, előnyösen metilén-klorid, etil-acetát 1 : 1 térfogat arányú elegye. A frakciókat gyűjtjük és antibakteriális aktivitásukat a bennük várt antibiotikumra érzékeny mikroorganiz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
