190814. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új poliéter típusú antibiotikumok előállítására
1 190 814 2 mussal, például Bacillus szubtilis-szel végzett biológiai módszerrel vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. Az így kapott maradékot valamely szerves oldószerben, például terc-butil-alkoholban, benzolban vagy p-dioxánban, előnyösen terc-butil-alkoholban oldjuk és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva-szárítás révén kapott szilárd anyagot alkalmas szerves oldószerben, például metilénkloridban, hexánban, metilén-klorid és etil-acetát elegyében, dietil-éterben, hexán és etil-acetát elegyében, hexán és kloroform elegyében vagy hexán és éter elegyében feloldjuk. Előnyösen dietil-étert használunk. Az így kapott oldatot vízzel kirázzuk, pH-ját híg ásványi savval 1,5-4,0 értékre, előnyösen 2,5-re állítva. A szerves fázist elválasztjuk, a savfelesleg eltávolítására vízzel mossuk, alkalmas szárítószeren szárítjuk, szüljük majd vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradékot alkalmas oldószerben feloldjuk, és hagyjuk, hogy az oldószer lassan párologjon el, ezt előnyösen 4 °C körüli hőmérsékleten érjük el. Alkalmas oldószerek például a metilénklorid, a hexán, a metilén-klorid-etil-acetát elegy, a dietil-éter, a hexán-etil-acetát elegy, a hexánkloroform elegy vagy a hexán-éter elegy, előnyösen hexán-éter 5 : 2 térfogat arányú elegye. A kapott kristályokat összegyűjtjük, mossuk, előnyösen 40 °C hőmérsékleten valamely közepes forráspontú szénhidrogénnel, például hexánnal vagy heptánnal, és levegőn szárítjuk. Ily módon az LL-C23 024a jelölésű antibiotikumot nyeljük szabad sav formájában. Ha só formájú terméket kívánunk, a szabad savat a megfelelő kationnal, azt előnyösen híg szervetlen bázis formájában alkalmazva, szakember számára ismert eljárással sóvá alakíthatjuk. A következő példák a találmány megvilágítására szolgálnak. Az alkalmazott táptalajokat az A, B, C stb. táptalajt az előzőekben ismertettük. Ha más megjelölés nem szerepel, minden eljárást szobahőmérsékleten - közelítőleg 22 °C-on - és légköri nyomáson végzünk. 1. Példa 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril B táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetéről mosott spórával beoltunk, majd rotációs rázógépen rázatva 2 napon át inkubáljuk. Ezt követően 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril C táptalajt az előbbi tenyészetből kivett 5% inokulummal beoltunk és rotációs rázógépen rázatva 28 °C hőmérsékleten 5 napon át inkubáljuk. Az antibiotikus aktivitás jelenlétét Staphylococcus aureus ATCC 6538 P-re, Bacillus subtilisre és Streptococcus feacalisra gyakorolt biológiai hatás, a féreghajtó aktivitást Caenorhabditis elegánsra kifejtett biológiai hatás vizsgálatával ellenőriztük. 2. Példa 7 db 500 ml-es lombikba a következő steril táptalajok 100-100 ml-ét tartalmazza: 1. Lombik: 100 ml C táptalaj. 2. Lombik : 100 ml C táptalaj, melyben a szójalisztet 1,5% gyapotmagliszttel helyettesítettük. 3. Lombik: 100 ml C táptalaj, melyben a szójalisztet 1,5% húskivonattal helyettesítettük. 4. Lombik : 100 ml D táptalaj. 5. Lombik : 100 ml E táptalaj. 6. Lombik : 100 ml F táptalaj. 7. Lombik : 100 ml G táptalaj. A lombikok mindegyikét B táptalajon tenyésztett Actinomadura yumaense NRRL 12 515 tenyészetből vett 5% inokulummal oldjuk be, majd rotációs rázógépen rázatva 28 *C hőmérsékleten 4-6 napon át inkubáljuk. A fenti tenyészetek mindegyikét aktívnak találtuk az 1. példában megadott antibiotikus aktivitásra vizsgálva és csirke-veseszövet-tenyészetben lévő Eimera tenella ellen coccidium ellenes aktivitásra vizsgálva. 3. Példa 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril B táptalajt fagyasztott fermentációs tenyészetből származó Actinomadura yumaense NRRL 12 515 sejtekkel oltunk be, majd 32 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 4 napon át inkubáljuk. Ezután a tenyészetből származó 5% inokulummal beoltunk 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril H táptalajt és 28 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 5 napon át inkubáljuk. Az antibakteriális hatást az 1. példában, a coccidium ellenes hatást a 2. példában megadott módon határozzuk meg. Az antibiotikus aktivitás jelenlétét vékonyrétegkromatográfiás eljárással, etil-acetát, kloroform 70 : 30 térfogat arányú futtatóeleggyel kifejlesztett szilikagél lemezen is vizsgáljuk. 4. Példa 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril A táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetéről lemosott spórával oltunk be, majd 32 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 2 napon át inkubáljuk. Ebből a tenyészetből származó 5% inokulummal oltunk be 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril H táptalajt, majd a beoltott táptalajt 32 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen 2 napon át inkubáljuk. A H táptalajon kifejlődött tenyészetből vett 5% inokulummal ezután 500 ml-es lombikban lévő friss, steril H táptalajt oltunk be és 28 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 6 napon át inkubáljuk. Az antibakteriális hatást az 1. példában megadott módon vizsgáljuk. 5. Példa 2 db 500 ml-es, 100-100 ml steril A táptalajt tartalmazó lombikot Actinomadua yumaense NRRL 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
