190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 2 190 803 TON-X-lOO-at, 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kalcium-kloridot és 2 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos trisz-(hidrogén-klorid)pufFerral (pH = 7,4) hozunk egyensúlyba. Miután alaposan átmossuk a fenti pufferral, 0,1 mól/1 lak- 5 tózt, 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kalciumkloridot és 0,005% TRITON-X-100-at tartalmazó 0,1 mólos trisz-(hidrogén-klorid)-pufferrel (pH = 7,4) eluálunk, és az így nyert eluátumot 48 óráig dializáliuk 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kai- 10 cium-kioridot és 2 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos triszt-(hidrogén-klorid)-pufferral, hogy 2 ml GRA oldatot nyerjünk. Az ily módon nyert GRA oldat fehérje és cukor tartalma 156 pg, illetve 94 pg. A továbbiakban ezt 15 „GRA-M-l”-ként említjük. (c) Körülbelül 120 g (vizes súly) KATO-III-at 100 ml PBS-sel (foszfátpuffer, amely nátrium-kloridot tartalmaz, pH = 7,6) homogenizálunk turmixgépben. Egy órás (100 000 xg) centrifugálás után 20 a pelletet oldjuk 100 ml, 2%-os TRITON-X-100-at, 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos trisz-(hidrogén-klorid)-pufferban (pH = 7,6). A felülúszót 1 órás ( 100 000 x g) centrífugálással összegyűjtjük, egy PNA-Sepharose-4B ősz- 25 lopra (0,8 x 15 mm) töltjük és az oszlopot egyensúlyba hozzuk 0,015 % -os TRITON-X-100-at, 0,15 mól nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos trisz(hidrogén-klorid)-pufferral (pH = 7,6). 50 ml-nyi pufferral való mosás után a GRA-t 0,1 mól/1 lak- 30 tózt tartalmazó fenti pufferral eluáljuk. Az eluált GRA-t 0,85%-os nátrium-klorid oldattal ismét dializáljuk, betöményítjük Sephadex-en (Pharmacia Co. terméke), és a használatig - 20 °C-on tároljuk. A fehérje és a cukor mennyiségét az (a) pont 35 szerinti eljárással határozzuk meg, melynek értéke 2,0 mg illetőleg 0,8 mg. Ezt a továbbiakban GRA-2-nek nevezzük. (d) A (c) pont szerint a következő GRA mintákat állíthatjuk elő: ú) 3. táblázat Az anyag GRA GRA minta eredeti mennyisége(g) fehérjetartalom (mg) cukortartalom (mg) GRA-3 BT-1 Mellrák 33 0,5 0,09 GRA-4 ! (kimetszés) 5 0,24 0,5 GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38 GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54 GRA-7 Raji 29 0,78 0,45 GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4 GRA-M-3 LIC 14,4 0,06 0,07 GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35 GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 (e) A (c) pont szerinti eljárással előállíthatunk GRA-t úgy is, hogy KATO-III helyett MKN-45-öt (kb. 29 g-ot) PNA-Sepharose-4B helyett az (1)-B 60 pont szerint nyert DBA-Sepharose-t használjuk és a (c) pont szerinti eljárással 0,01 mólos trisz-(hidrogén-klorid)-pufferraI - amely N-acetil-galaktózamint is tartalmaz - eluáljuk. A nyert GRA készítmény 0,03 mg fehérjét és 0,01 mg cukrot tartalmaz. 65 A továbbiakban ezt „GRA-8”-nak nevezzük. (0 A (d) pont szerinti GRA-3 5 ml-ét egy DBASepharose oszlopra visszük és 0,01 mólos trisz(hídrogén-klorid)-pufferral, pH = 7,2 eluálunk (0,015% TRITON-X-100, 2 mmól/1 magnéziumklorid, 2 mmól/1 kalcium-klorid és 0,85% nátriumklorid), hogy 4 ml-es frakciókat nyeljünk 1-12-ig. Az 1-3 frakciókat GRA-3-A-nak, 4-12-ig GRA-3-B-nek nevezzük. Ezután az oszlopot eluáljuk, ugyanazzal a pufferral, amely még 0,1 mól N-acetil-galaktóz-amint is tartalmaz, így a GRA-3-C jelzésű frakciót kapjuk. (g) SDS gél elektroforézis Minden, a fenti eljárásokkal előállított GRA készítményt a Fairbanks által előírt elektroforézisnek vetjük alá. [Fairbanks és munkatársai, Biochemistry 10. k. 2606 oldal (1971)]. A kapott eredményeket az ábrák 17-21-ig mutatják. A 17-18. ábrán a számok 1—5-ig a következőket mutatják : 1 - standard, 2 - GRA-M-3, 3 - GRA-7, 4 - GRA-1, és 5 - GRA-2. A 19. ábrában a számok 1-4-ig a következőket mutatják: 1 - standard, 2 - GRA-M-2, 3 - GRA-6, 4 - GRA-5. A 20. ábrán a számok 1—3-ig a következőket mutatják : 1 - GRA-M-4, 2 - GRA-M-5, 3 - standard. A 21. ábrában a számok 1-4-ig a következőket mutatják : 1 - GRA-3, 2 - GRA-3-A, 3 - GRA-3-B, 4 - GRA-3-C. A 17. ábra a fehérje festési reakciónak alávetett GRA állapotát mutatja C. B. B. technika szerint. [Fairbanks és munkatársai Biochemistry 10. k. 2606 oldal, (1971)]. A 18-20. ábra a PAS festési reakciónak alávetett GRA állapotát mutatja. [Zacharius R. M. és munkatársai Anal. Biochem. 30. k. 148. oldal (1962)]. A 21. ábra a C. B. B. fenti festési módszer eredményének sematikus ábrázolása. Az alábbiakban megadjuk a használt standard anyagok listáját [Biorad Lab. Calif, terméke, Amerikai Egyesült Államok] 200 K dalton, miozin 116 K dalton, ß-galaktozidüz 92.5 K dalton, foszforiláz 66,2 K dalton, BSA 45 K dalton, ovalbumin 21.5 K dalton, szójabab tripszin inhibitor 3. Tájékoztató példa (a) Japán majom lépét (4 kg) ; (beszerzési forrás a Japán Plymates Co. Ltd.) kimetsszük és kétszer RPMI-1640 tenyészközeggel (a Flow Laboratory Co. terméke) mossuk. A sejteket szitával (a Millipore Inc. terméke, lyukbősége 150 mesh) kiszűrjük, majd a sűrűségkülönbség alapján centrifugáljuk, (sűrűség 1,076), hogy 2 liter, 2x 199/ml Hmfocitát tartalmazó szuszpenziót nyerjünk. Áz így kapott limfocitákat háromszor RPMI-1640 tenyészközeggel mossuk, majd a limfociták számát 5 x 107/ml-re 6
