190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 190 803 2 állítjuk be a fenti tenyészközeggel, amely 10% FCS-t is tartalmaz. Ezután 37 °C-on egy órán át széndioxidos fermentáló készülékben állni hagyjuk. A felülúszó limfocitákat visszanyerjük és számukat 1 x 10Vml-re állítjuk be a fenti tápközeggel, amely 1 % FCS-t is tartalmaz. Ezt követőleg 1 pg/ml indometacint (a Sigma Laboratories Inc. terméke) és 2% PHA-P-t (tisztított fíthemagglutinin) (a Difco Co. terméke) adunk hozzá és széndioxidos fermentáló készülékben, 37 “C-os hőmérsékleten 48 óráig tenyésztjük. Ezután centrifugálással választjuk el (3000 ford/perc) 10. percen át, a felülúszót visszanyerjük és Millipore szűrőn (a Millipore Inc. terméke 0,2 pm) szűrve csíramentesítjük, hogy 21TCGF- et (T sejt növekedési faktor, interleukin-2) nyerjünk. (b) A TCGF-et tíz egészséges donor perifériás véréből származó kevert limfocita tenyészetnek felülúszójából nyerjük. C. F. szerint (Conray Ficol Japan Immunoreseardh Co.) szeparált limfócitákból 37 'C-on 1 órás szuszpendálással műanyag felületen készített nem-összetapadó limfocitákat 1 %-os FCS tartalmú RPMI 1640-es oldattal szuszpendáljuk (1,5 x 10e sejt/ml) és inkubáljuk 0,2% PHA-P- vel, indometacinnak (1 pg/ml) és 50 pg/ml) mitomicin C-vel előkezelt humán B sejtvonallal. Negyvennyolc óra múlva a tenyészet felülúszóját begyűjtjük és TCGF forrásként használjuk [Inone és munkatársai, Scand. J. Immunoi. 12, 149-150. oldal (1980)]. 4. Tájékoztató példa A limfociták készítése (1) Humán perifériás vérből származó limfociták 50 ml heparinizációs eljárással egészséges felnőttből vagy különböző rákos betegekből nyert vért centrifugálással elválasztunk Ficol Pack (a Farmacia Japan Co. Ltd. terméke) alkalmazásával, hogy 5 x 107/ml perifériás vérből származó limfocitát nyerjünk. (2) Egérlép limfociták C3H/He egerekből (hím 6 hetes) kimetsszük a lépet és kétszer RPMI-1640 tenyészközeggel mos-1 2 * * suk. Ekkor a lépet injekciós tűvel megdolgozzuk és egy rozsdamentes acélból készült szitán (100 mesh) átnyomjuk, hogy eltávolítsuk a nagyobb darabokat. Az igy átszűrt sejteket háromszor ugyanazzal - a fentiekben alkalmazott - tápközeggel átmossuk és centrifugálással elválasztjuk 1200 ford/perccel 10 percig, hogy 4 x 107/ml léplimfocitát nyerjünk. 1. példa A (2) (a) tájékoztató példa szerint nyert GRA-l-t (fehérjemennyiség 40 pg/ml, cukormenynyiség 7,5 pg/ml) az eredeti térfogat ezerszeresére hígítjuk RPMI-1640 tápközeggel, amely 15% FCS-t tartalmaz, hogy elkészítsük az érzékenyítő táptalajt. A 4. tájékoztató példa (1) pontja szerinti humán perifériás vérből származó limfocitákat (5 x 10®/5 ml) adunk a fentiek szerint készített érzékenyítő . tápközeg 5 ml-éhez és Petri-csészébe helyezzük, majd 37 °C-on 2 napig tenyésztjük. A (3) tájékoztató példa szerinti eljárással nyert 20% TCGF és 15% FÇS tartalmú RPMI-1640 tenyészközégen továbbtenyésztjük azokat további 5 napig, hogy a killer sejtek 20 ml-es olyan oldatát nyerjük, amelynek minden ml-ben 1 x 106-on killer sejt van. Ezt a továbbiakban „GRA-l-K-T”-ként említjük. 2. példa A (4) tájékoztató példa (2) pontja szerinti eljárással nyert egérlép limfociták számot 5 x lO^ml-re állítjuk be, 15% FCS tartalmú RPMI-1640 tápközeggel. Ekkor a (2) tájékoztató példa (b) pontja szerinti eljárással nyert GRA-M-l-t adunk hozzá úgy, hogy a cukor és a fehérje végső mennyisége 0,9 pg/ml illetve 1,5 pg/ml legyen. A kapott keverék 5 ml-ét Petri csészén tenyésztjük (60 mm x 15 mm, a Falcon Co. terméke), 37 °C hőmérsékleten 2 napig. A kiónok képződését megfigyeljük. Ezt követően továbbtenyésztjük 15% FCS tartalmú és 20% TCGF tartalmú (a Japan Immuno Research Láb. Co., Ltd. terméke) RPMI-1640 tápközegen 4 napig, így 50 ml 1 x l06/ml killer sejtet tartalmazó oldatot kapunk. Ezt a továbbiakban „GRA-M-l-K-T”-nek nevezzük. 3. példa Egészséges donor perifériás véréből származó limfocitákat (5 x 10®/ml) 50 ng/ml (proteintartalom) GRA-2-t és 15% FCS-t tartalmazó RPMI-1640 tápközegen inkubálunk 37 °C-on. A második napon a fenti humán eredetű TCGF-t adjuk az oldathoz, addig, amíg a koncentráció el nem éri a 20 %ot. Az inkubálást további 3 napig folytatjuk, hogy killer sejteket nyerjünk. Az alábbiakban ezt GRA-2-K-T-nek nevezzük. 4. példa Killer sejt készítményeket, így a GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T és GRA-3-C-K-T, az 1. példa szerinti eljárással állítunk elő GRA-8-at, GRA-3-A-t, GRA-3-C-t (fehérjetartalmuk 50 ng/ml) és a 3. tájékoztató példa (b) pontja szerint nyert TCGF-et használva. 5. példa C3H/He egér (nőstény, 8 hetes) bőrébe ugyanabból a törzsből származó 106 x 5563 sejtet ültetünk. A daganatot sebészi úton hét nap múlva eltávolítjuk. Újabb hét nap múlva ugyanabból a törzsből származó 105 x 5563 sejtet oltunk az állatba. Azt az egeret, amely rezisztens az oltással szemben, immunis egérnek nevezzük. Mind az immunis egér, mint a normál C3H/He egér lépének sejtjeit feldolgozzuk a szokásos technikával. A lépsejteket érzékenyítjük 40 ng/ml kon5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
