190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 190 803 2 1. táblázat folytatása PNA DBA SBA NB-l neuroblasztoma 50,9 1,7 YT-nu neuroblasztoma 3,6 0,5 TGW-nu-1 neuroblasztoma 4,1 0 TGW- nu-11 neuroblasztoma 2,0 1,0 GOTO neuroblasztoma 0,5 0 ITO embrionális karcinoma . 96,9 12,3 NEC-8 embrionális karcinoma 44,6 0 SCH koriokarcinoma, gyomor 14,6 3,1 GCH kriokarcinoma, méhben 5,4 0 YN-1 rhabdomioszarkoma 5,7 1,7 Mouse plazmacitoma 92,0 0 90,6 Mouse májdaganat 18,6 0 6,4 A rákos betegekből származó rosszindulatú szövetet rozsdamentes acélhálón átnyomjuk (lyukbősége 150 mesh), így olyan szuszpenziót készítünk, melyben a sejtek egyenként helyezkednek el. Miután 2 mmól/1 kalcium-kloridot, 2 mmól/1 magnézium-kloridot és 0,85% nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos trisz(hidrogén-kloridos)pufferral (pH 7,4) kétszer átmostuk, 5 x 105 sejtet újra szuszpendálunk 100 pl pufferben. A sejt-szuszpenzióhoz 100 pl PNA-FITC-t vagy DBA-FITC-t (200 pg/ml) adunk, összekeverjük és szobahőmérsékleten 20 percig inkubáljuk. Ezután háromszor mossuk hideg PBS-sel (0,15 mólos foszfát puffer, amely nátrium-kloridot tartalmaz és pH értéke 7,6) és a sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. Az eredményt a 2. táblázatban szemléltetjük. A rákos betegekből származó malignus szövetet a Kansai Medical University bocsátotta rendelkezésünkre. 2. táblázat GRA Sorszám Rákos szövet ---------------------PNA DBA 1 gyomorrák + + 2 gyomorrák + + 3 gyomorrák-4 gyomorrák +-5 gyomorrák + + 6 gyomorrák +-7 emlőrák + — 8 emlőrák +-9 emlőrák +-10 emlőrák + + 11 vastagbélrák + + 12 vastagbélrák + 13 nyelőcsőrák +-14 májdaganat — + Megjegyzés: + jelölés: a GRA megjelent a sejtfelszínen,- jelölés: a GRA nem jelent meg a sejtfelszínen. 2. Tájékoztató példa A GRA előállítására (1) - A Kötött lektin előállítása (PNA-Sepharose) 3 g bróm-ciánnal aktivált Sepharose^4B-t (a Farmacia Corp. terméke) alaposan átmosunk 1 mmól/1 sósav-oldattal és 200 ml 0,1 mólos nátriumhidrogén-karbonátban (pH 8,5) szuszpendáljuk. Azután 5 ml 20 mg PNA-t tartalmazó 0,01 mól foszfátpuffert (pH 8,5) adunk hozzá és 25 °C hőmérsékleten 2 órán át reagáltatjuk időnkénti keverés mellett, hogy elkészítsük a PNA-Sepharose-t. (1) - B Hasonló módon, mint a fenti (1)-A pontban, használhatunk DBA-t PNA helyett és ekkor DBA-Sepharose-t kapunk (Dolichos bab). (2) GRA készítése (a) BT-1 (Burkitt limfoma) sejteket (1,3 x 108) háromszor fiziológiás sóoldattal mosunk és 30 ml 0,01 mólos trisz-(hidrogén-klorid)-puffert (pH = 7,4) - amely 2% TRITON-X-100-at (a Wako Pure Chemical Industries Ltd. terméke), 0,85% nátriumkloridot, 2 mmól/1 kalcium-kloridot és 2 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmaz - adunk hozzá. A keveréket 4 °C-on 15 percig keverjük és ultracentrifugával elkülönítjük (100 000 x g). Az így nyert 28 ml felülúszó folyadék 14 ml részletét átbocsátjuk egy oszlopon (átmérő 0,5 cm, hosszúság 1 cm), affmitási kromatográfiát végezve; az oszlop PNA-agarózos töltetű (a Maruzen Co., Ltd. terméke), amelyet 0,1% TRITON-X-100, 0,85% nátrium-klorid, 2 mmól/I kalcium-klorid és 2 mmól/1 magnézium-klorid-tartalmú trisz-(hidrogénklorid)-pufferral (pH 7,4) egyensúlyoztuk ki. A fenti pufferral való mosás után a 0,01 mólos trisz-(hidrogén-klorid) (pH = 7,4)-pufferral eluálunk, amely 0,1 mól/1 laktózt, 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kalcium-kloridot, 2 mmól/1 magnézium-kloridot és 0,1% TRITON-X-100-at tartalmaz. Az így eluált részt 0,01 mólos trisz-(hidrogénklorid)-pufferral szemben - amely 0,85% nátriumkloridot, 2 mmól/1 magnézium-kloridot és 2 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz - 48 órán át dializáljuk, és így 17 ml GRA oldatot kapunk. A GRA oldatban meghatározzuk a fehérje és a cukor mennyiségét a Folin-Lowry, illetve a fenol-kénsav-módszerrel és ennek értékét 644 pg-nak illetve 120 pg-nak találjuk. Ezt az oldatot a továbbiakban „GRA-1”ként említjük. (b) C3H egér emlőrák (MMT) sejteket (1 x 1010) háromszor fiziológiás sóoldattal mosunk és 30 ml 0,01 mólos trisz-(hidrogén-klorid)-puffert (pH 7,4) adunk hozzá, amely 2% TRITON-X-100-t 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kalcium-kloridot és 2 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmaz. Az elegyet 4° C-on 30 percen át keverjük. Ezt követően ultracentrifugával elválasztjuk (100 000 xg) 2 órán át, és a felülúszó folyadékot egész éjjel 0,1 mólos trisz(hidrogén-klorid)-pufferral szemben (pH = 7,4) - amely 0,85% nátrium-kloridot, 2 mmól/1 kalciumkloridot és 2 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmaz - dializáljuk. A dializált folyadékot 3 ml-re betöményítjük és ennek 1 ml-es részletét engedjük affmitási kromatográfiás oszlopon (átmérő 0,5 cm, hosszúság 2 cm), amely a fentiekben leírt PNA-Sepharose töltetű, és amelyet előzőleg 0,005% TRI-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
