190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 190 803 . 2 sóoldatot, nem vizes vivőanyagként pedig növényi olajat, például szezámolajat, ásványi olajat, például paraffint, állati olajat, például szkvalént vagy propilénglikolt. Az immunológiai hatás fokozása érdekében megfelelő adjuvánst is adhatunk hozzá, amely lehet a Freund-féle komplett adjuváns, állatok számára lehet a szaponin, emberek számára aluminium-hidroxid. Rákos betegek kezelésére a találmány szerinti készítményeket adhatjuk egy alkalommal vagy hosszú időn át ismételve, de adhatjuk megelőzésképpen is olyan személyeknek, akik ki vannak téve a rákbetegség veszélyének. A GRA LDS0 értéke (egérben, intraperitoneálisan) cukorként számítva 500 mg/kg, így a találmány szerinti rákellenes hatóanyag kis toxicitású és ennél fogva széles határok között változtathatjuk az alkalmazott dózis mennyiségét. Bár a GRA koncentrációja a találmány szerinti rákellenes készítményekben nem alapvető fontosságú, mégis előnyös, ha a cukorként számított mennyisége 0,001 és 10 pg/ml között van. Előnyös, ha a rákellenes hatóanyagot 0,001-1,000 pg/kg/nap mennyiségben adagoljuk, egyszerre vagy több apró dózisban elosztva, ez azonban függ a betegség kiterjedésétől, a beteg korától és nemétől is. Az ilyen módon elkészített, a killer sejteket mint hatóanyagot tartalmazó rákellenes szert előnyösen alkalmazhatjuk injekció alakjában és kombináljuk olyan vivőanyagokkal, amelyek hasonló vérkészítményeknél elterjedten használatosak. A felhasznált vivőanyagok fajtái nem döntőek, de a vérrel izotóniás vivőanyagok alkalmazása előnyös. Különösen előnyös, ha hordozóként fiziológiás sóoldatot használunk. A hatóanyag készítésekor előnyös, ha a killer sejteket elegendő mennyiségű fiziológiás sóoldattal vagy ehhez hasonlóval mossuk, annak érdekében, hogy eltávolítsuk a fentiekben leírt tápközeget, és a killer sejtek lebegjenek a hordozóban. A killer sejtek koncentrációja nem szigorúan meghatározott, de előnyös, ha 101 * * * 5 * * * és 109/ml közötti értékeket alkalmazunk. Ha a killer sejteket 10® koncentrációban intraperitoneálisan adagoljuk egereknek, nem észlelünk toxikus elváltozásokat. Bár a találmány szerinti rákellenes készítmény dózisa függ a betegség súlyosságától, a beteg korától és nemétől, általában előnyös, ha a készítményt 10s és KP/kg/nap dózisokban adagoljuk, egyszerre vagy több részletben. A továbbiakban a találmány tárgyát, annak oltalmi körének szűkítése nélkül, tájékoztató, kísérleti és összehasonlító példákkal szemléltetjük. 1. Tájékoztató példa A GRA lokalizálása (1) - A FITC-tal (fluoreszcein-izotiocianát) jelzett lektin készítése (PNA-FITC). 10 mg amerikai mogyoró lektint (PNA, az E Y, Laboratories, Inc. California terméke) oldunk 2 ml 0,01 mólos, 0,85% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferben (pH = 7,2). 1 ml 0,5 mólos hidrogén-karbonát puffert oldunk (pH = 9) 2 mg FITC-ban (Sigma Laboratories Inc. terméke), az így kapott oldat 0,5 ml-ét a fentiek szerinti PNA-pufferoldathoz adjuk. Az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, ezt követően Sephadex G 25-ön (10 mm x 300 mm, Farmacia Corp. terméke) különítjük el. A kezdő csúcsot összegyűjtjük. FITC/PNA aránya 1,0. (1) - B FITC-tal jelzett lektin készítése (DBAFITC) Dolichos bab agglutinin. Hasonló módon mint az (1)-A pontban DBA-FITC-ot nyerünk, a használt DBA az E. Y. Inc, terméke. A FITC/DBA hányadosa = 0,9. (1) - C FITC-tal jelzett szójabab agglutinin (SBA-FITC) beszerezhető az E. Y. Inc.-től A FITC/SBA hányadosa =1,4. (2) A GRA helye különféle rákos sejtekben. (a) A tenyésztett emberi ráksejteket (1 x 10e) 0,85%-os nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mólos trisz(hidrogén-klorid)-pufferral (pH 7,2) háromszor mossuk, centrifugáljuk és ezután - a fenti (1) példában leírt eljárással készített -FITC-PNA vagy FITC-DBA vagy FITC-SBA 100 ml-ét (200 pg/ml)-t adjuk hozzá. A kapott elegyet szobahőmérsékleten 30 percig állni hagyjuk. A reakció befejeződése után, a reakcióelegyet háromszor 0,85% nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos foszfátpufferral (pH 7,2) mossuk, ezután a sejteket tárgylemezre helyezzük és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. Az alkalmazott rákos sejtek mindegyike ismert, származási helyük a First Pathology Laboratories, .Medical Departmant of Niigata University. 1. táblázat Ráksejtek A GRA előfordulási aránya (%) PNA DBA SBA Raji Burkitt limfoma 98,3 1,4 Dauji Burkitt limfoma 93,1 5,2 BT-L Burkitt limfoma 50,1 0 P-12 T-sejt limfoma 44,3 6,7 MOLT T-sejt leukémia 0,6 4,8 Fujimaki B-sejt limfoma 19,1 5,3 Oda IgD mieloma 0,6 10,0 QG-56 tüdőrák, (laphám sejtes) 70,4 2,0 PCI tüdőrák (laphám sejtes) 78,4 0,4 PC-3 tüdőrák, (adenokarcinoma) 77,1 0 QG-90 kis sejtes tüdőrák 68,0 0 PC-13 nagy sejtes tüdőrák 17,0 0 MK-2 alacsony differenciált gyomorrák 63,7 0,1 KATO-IH MKN-45 MKN-1 pecsétgyűrűsejtes gyomorrák kevéssé differenciáit gyomorrák gyomorrák, (laphámsejtes adenokarcinoma) 57,3 1,0 4,6 0 40,3 0,4 MKN-28 gyomorrák 0,4 0,1 MKN-74 gyomorrák 0,5 0 MGH-UI hólyagrák 37,4 0 KU-2 hólyagrák 4,5 21,4 T-24 hólyagrák 14,6 0 NBT-2 hólyagrák 13,1 1,0 NRC-12 veserák 23,9 0 KU-1 veserák 3,3 0,6 Kuramochi petefészekrák 80,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
