190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 190 803 2 melyek megkötik a biológiai anyagokat enyhe körülmények között, és kémiailag és fizikailag stabil. A nem oldódó hordozó készülhet cellulózból, így amino-metil-cellulózból, karboxi-metil-cellulózból, bróm-acetil-cellulózból, p-anilino-cellulózból, lehet keresztkötéseket tartalmazó dextrán alapanyagú hordozó, például Sephadex és CM Sephadex (Farmacia Corp. terméke), lehet agaróz alapú hordozó, mint a Sepharose 4B, Sepharose 2B és a Sepharose 6B (a Farmacia Corp. terméke). A fentiek szerinti bróm-ciánnal aktivált hordozó és a lektin kapcsolódási reakciójában az aktivált hordozó a lektin mennyiségének 30-80-szorosa; a vegyületeket megfelelő oldószerben reagáltatjuk, például nátrium-hidrogén-karbonát 0,1 mól/liter vizes oldatában (mely 0,5 mól/liter nátrium-kloridot tartalmaz, a pH értéke 8,4), a hőmérséklet 0 és 40 °C közötti lehet. Előnyös azonban, ha 2 és 8 °C között tartjuk az oldatot 10-20 órán át. Ezen a módon nyerünk lektintartalmú hordozót a kromatográfiás eljáráshoz. A fenti módon készített lektintartalmú hordozót alkalmazó kromatográfia során a kívánt GRA a lektintartalmú hordozóhoz kapcsolódik és az oszlopban marad. Azok az anyagok, amelyek kapcsolódni képesek a lektinnel, áthaladhatnak az oszlopon, egy kicserélődési reakcióban véve részt, vagy más módszer szerint egy adszorpciós elkülönítőt (eluáló oldat), például kálium-tiocianát nagytöménységű vizes oldatát és egy nitrát puffert bocsátunk át az oszlopon a disszociáció érdekében, így a kívánt GRA-t nyerjük. A kicserélődési reakcióban az anyagminta képes a lektinhez kapcsolódni, ha az affinitás-kromatografálás során olyan hordozót használunk, amely galaktózkötő lektint tartalmaz, beleértve azokat, amelyek alkalmasak olyan terminális galaktózhoz kapcsolódni mint például a galaktóz, diszacharidok és oligoszacharidok, melyek terminális galaktózt tartalmaznak, valamint az anyagminta alkalmas a lektinnel való kapcsolódásra akkor is, ha az affinitás kromatografálás során olyan hordozót használunk, mely N-acetil-galaktóz-amin-kötő lektint tartalmaz, beleértve azokat, amelyek alkalmasak a kapcsolódásra a terminális N-acetil-galaktózaminnal vegyülő lektinnel is. Ilyen például az N-acetil-galaktóz-amin, a diszacharidok, amelyek terminális N-acetil-galaktóz-amint és oligiszacharidok, amelyek végállású N-acetil-galaktóz-amint tartalmaznak. Az ilyen módon előállított GRA terminális galaktóz és/vagy N-acetil-galaktóz-amint tartalmazó glükoproteint, glükolipidet és/vagy szacharidot tartalmaz. Az így előállított GRA liofilezhető és kívánt esetben még tisztább anyagot állíthatunk elő, ennek során a szokásos tisztítási eljárásokat alkalmazzuk. Például a galaktóz-kötő lektinnel izolált GRA készítményeket egy olyan elkülönítési eljárásnak vethetjük alá, ahol terminális N-acetilgalaktóz-aminhoz kapcsolódó lektint használunk, míg az N-acetil-galaktóz-aminhoz kapcsolódó lektinnel izolált GRA készítményeket az elkülönítési eljárás során a galaktóz-kötő lektinnel kezelhetjük. A limfociták eredete nem fontos, és egyaránt használhatunk ép, egészséges, vagy rákos emberi szervezetből vagy állati szervezetből származó limfocitákat a perifériás vérből, a csontvelőből, nyirokcsomóból, lépből, mandulából és a csecsemőmirigyből. A limfocitákat fizikai vagy kémiai módszerek segitségével, membrán-felszín módszerrel [The Japanese Journal of Chemical Pathology-ban ismertetett módszer, 25. különszám (1976) 105. oldal] vagy más módszerrel különítjük el. A limfociták GRA-val történő érzékenyítését a limfocitáknak GRA-tartalmú tápközegen végzett tenyésztésével végezzük 1-10 nap alatt, előnyösen 2-7 nap alatt. A limfociták érzékenyítésére bármely, általában a sejttenyésztéshez használatos közönséges tápközeget használhatunk. Jól használható tápközegek : aRPMI 1640 tápközeg [J. A. M. A.-ban, 799(1967) p. 519. leírt tápközeg], az Eagle MEM tápközeg [Science-ben, 130 (1959) p. 432 tápközeg], mindezek emberi szérummal, borjúembrió szérummal (FCS), borjúszérummal, lószérummal vagy más hasonló szérumokkal kiegészítve. A tenyészethez adandó GRA mennyisége cukor-mennyiségként számolva 1-1000 mg/ml, előnyösen 1-500 mg/ml 1 x l06/ml limfocitára. A tenyésztést hagyományos módon végezzük, például kb. 7,2 pH-n 37 °C körüli hőmérsékleten. A találmány szerint előállított killer sejtek lényegében „közönséges” limfociták és specifikus GRA elleni aktivitással rendelkeznek. Például a GRA-l-KT, amely egyike a találmány szerinti killer sejteknek, tulajdonságai hasonlóak az emberi perifériás vér T sejtjeihez, és specifikus sejtpusztító aktivitást mutat a GRA-t tartalmazó ráksejtek ellen, amint azt az alábbiakban ismertetjük. A találmány szerinti új killer sejtek jellemző példája a GRA-l-KT és a GRA-M-1, amelyek előállítását az alábbiakban leírt példákkal mutatjuk be. A találmány összes killer sejtje a rendelkezésre áll, a feltalálótól beszerezhető. A találmány szerinti killer sejteket korlátlanul szaporíthatjuk a fent leírt, T sejt növesztő faktort is (TCGF-IL-2) tartalmazó táptalajon. Ebben az esetben a killer sejtek kiónjainak szelektív tenyésztését ultrahígításos módszerrel valósítjuk meg. Ezeket a killer sejteket hosszú ideig tárolhatjuk, például folyékony nitrogénben. A GRA önálló hatóanyagként és más baktérium- és rákellenes szerekkel együtt is alkalmazható. A találmány szerinti GRA-t hatóanyagként tartalmazó rákellenes szerek bármely formában kiszerelhetők, mindaddig, amíg olyan állapotúak, hogy a GF.A-t hatásos mennyiségben tartalmazzák. A hatóanyagot intravénásán, szubkután, bőrbe vagy intramuszkulárisan, oldat, szuszpenzió vagy emulzió formájában alkalmazhatjuk. A hatóanyagot elkészíthetjük előre száraz termék formájában is, amelyet oldatba vihetünk megfelelő vivőanyag hozzáadásával. A folyadék, melyben az oldást végezzük, tartalmazhat szuszpendáló szert, például metil-cellulózt, emulgeáló szert, például lecitint, tartósítószereket, például metil-p-hidroxi-benzoátot, és olyan stabilizáló szert, amely nem vált ki semmilyen immunválaszt emberből vagy állatból, puffert és más hasonlókat. Vizes vivőanyagként alkalmazhatunk fiziológiás 5 10 15 20 25 30 '35 40 45 50 55 60 65 3
