190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 ! 2 190 803 A találmány tárgya ráksejtellenes limfociták (a következőkben „killer sejtek” = „gyilkos funkciójú sejtek”) előállítási folyamatára vonatkozik.Részletesebben az olyan killer limfociták előállítási eljárására vonatkozik, melyek szénhidrátot tártál- 5 mazó antigént (ezt az antigént a ráksejtekből nyerjük és az alábbiakban „GRA”-val jelöljük) tartalmaznak és ráksejtekre hatnak, ezeket pusztítják. A találmány tárgya továbbá rákellenes hatóanyag előállítása, mely killer sejtet vagy GRA-t tartalmaz 10 hatóanyagként. Az immunválasz effektor sejtjei, főleg a T-limfociták, jelentős szerepet játszanak a sejt közvetítette immunválaszban és a szervezetbe került idegen sejt antigénjeinek "köszönhetően az átültetett szövet ki- 15 lökődését okozzák. Rákos sejtekkel szemben a limfocitáknak ez a tevékenysége nem figyelhető meg vagy igen csekély, így a ráksejtek nem pusztulnak el, hanem tovább élnek és az élő szervezetben elszaporodva végül a rákhordozó gazdaszervezet halálát 20 okozzák. Mindamellett a szervezet önfelismerő képességéért (vagyis, hogy egy szervezet mit ismer el sajátjának és mit idegennek) felelős mechanizmus még nem teljesen tisztázott és különböző kutatások 25 folynak, hogy bepillantást nyerjünk ezen rendszerek anyagi természetébe. Például a sejtfelszíni markerek esetében, az egérleukémia sejtjein vagy az embrionális karcinoma sejtjein alkalmazzák a lektineket, mint a Dolichos biflorus agglutinint (DBA) 30 és amerikai mogyoró agglutinint (PNA), lásd Biochem. Biophys. Rés. Comm.-ban [89 (2) 448-455 (1979)], uo. [96 (4) 1547-1553 (1980)], J. Biochem.ben [89 473-481 (1981)] és Cell.-ben [18 183-191 (1979) szeptember]. 35 Tudomásunk szerint nincsen olyan kísérlet, mely új limfocitákat állítana elő, amelyek képesek felvenni a specifikus küzdelmet a rákos sejtekkel és nincs olyan rákellenes hatóanyag sem, amely felhasználható a limfociták immunválaszának kivál- 40 tására. A találmány szerinti eljárással a killer sejteket készíthetjük olyan módon például, hogy GRA-t használunk a limfociták érzékennyé tételére. A fenti módon használt GRA-t emberi és állati 45 GRA-tartalmú ráksejtekből nyerhetünk, például ráksejt tenyészetekből, átültetett ráksejtekből, spontán előforduló ráksejtekből, kémiai anyaggal vagy vírus által előidézett ráksejtekből és műtéti úton eltávolított rákos szövetből, a következő eljá- 50 rással. A sejtmembrán alkotórészeit elválasztjuk a rákos sejttől az alábbiakban ismertetett módon és lektinnel kezeljük, amely specifikusan kapcsolódik a terminális N-acetil-galaktóz-aminhoz, ahol is a GRA 55 lektinhez kapcsolódik és így könnyen elkülöníthetjük, lásd J. B. C.-ben [250, 8518-8523 (1975)], Biochem. Biophys. Rés. Comm.-ben [62, 144 (1975)]; Z.” Immunitätsforsch.-ban [138, 423-433 (1969)], Br. J. Exp. Pathol.-ban [27, 228-236 (1946)]; Proc. -, Nat. Acad. Sci.-ben [75, 5. sz. 2215-2219 (1978)]; Biochemistry-ben [13, 196-204 (1974)] Carbohydrate Research-ben [51, 107-118 (1976)]. Alkalmas példák a lektin és az N-acetíl-galaktózamin kapcsolódására a Dolichos bab (Dolichos 65 biflorus) agglutinin, és a szójabab (Glycine hispida) lektin. A ráksejt membránjának alkotórészeit elkülöníthetjük olyan ismert eljárásokkal, mint a homogenizálás vagy az oldási eljárás, azaz oldást elősegítő anyagot használó szolubilizációs módszer. Még előnyösebb, ha olyan eljárást alkalmazunk, amelyben a ráksejteket fiziológiás sóoldatban vagy megfelelő puffer-elegyben homogenizáljuk. A kicsapódott részt összegyűjtjük centrifugálással, oldjuk fiziológiás sóoldatban, vagy puffertartalmú oldatban, oldódást elősegítő anyagot használva és a felülúszó részt centrifugálással különítjük el. Oldódást segítő anyagként használhatunk felületaktív anyagokat, amelyek a sejtmembránt oldani képesek : ilyenek például a nemionos felületaktív anyagok, mint pl. a TRITON X-100 (a Wako Pure Chemical Industries Ltd terméke), NP-40 (Shell Co. Ltd. terméke), a digitonin, karbamid és anionos felületaktív anyagok, pl. a nátrium-dodecilszulfonát (SDS). Az így kapott sejtmembrán alkotórészektől a lektinnel kapcsolódni képes GRA-t el lehet különíteni a szokásos fizikai-kémiai vagy biokémiai eljárásokkal, amelyek a lektin sajátságait hasznosítják. Az ilyen eljárások a lektintartalmú töltetet alkalmazó oszlopkromatográfia, az olyan immun kicsapásos eljárás, amely a GRA antitestjét vagy hasonló anyagot használ, a dialízises eljárás, a gélszűrési eljárás, az elektroforózises módszer, és olyan fizikai kicsapási eljárás, amelyben cukrot és fehérjét kicsapó anyagot alkalmazunk, pl. polietilénglikolt és acetont, valamint ezek kombinációját. Előnyösebb a lektint tartalmazó oszlopon végzett affinitáskromatográfia. A lektintartalmú hordozót könnyen elkészíthetjük úgy, hogy a lektint oldhatatlan hordozóhoz kötjük. A lektin megkötését egy oldhatatlan hordozón megvalósíthatjuk azokkal az ismert módszerekkel, amelyeket biológiai anyagok rögzítésére használunk. Ezen módszerek közül előnyös a poliszacharidok bróm-ciános aktiválási eljárása és az N-hidroxi-szukcinimidésztert alkalmazó rögzítés. A poliszacharidok bróm-ciános aktiválása olyan módszer, melyben egy oldhatatlan hordozót bróm-ciánnal kezelünk és az eljárás során nyert aktivált terméket használjuk fel a lektinnel való kapcsolási reakcióban. Az oldhatatlan hordozó bróm-ciános kezelésekor a pH 7,5 és 12 közötti tartományának biztosítására használhatunk bázisos vegyületeket, pl. nátrium-hidroxidot, nátrium-hidrogén-karbonátot, a hordozót pedig kezelhetjük vízben, acetonitrilben, vagy valamely puffertartalmú oldatban, ahol a pH-t 0,1 mól nátrium-hidrogén-karbonát pufferral (a pH körülbelül 8,7) és 0,01 mól foszfát-pufferrel (a pH körülbelül 7,7) tartjuk 7,5 és 12 közötti tartományban. A kezelést szobahőmérsékleten végezzük 1-től 12 percig. Előnyös, ha a bróm-cián mennyisége egyenlő az oldhatatlan hordozó mennyiségével. A találmány szerinti eljárásban bármely ismert oldhatatlan hordozó alkalmazható, amely nem specifikusan adszorbeálja a biológiai anyagokat, nagy porozitású, funkciós csoportokat tartalmaz, 2
