190747. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás reagenskészlet progeszteron kimutatására és meghatározására biológiai folyadékokból
1 190 747 2 Bármely kereskedelmi forgalomban lévő termék használható. (Pl. a HUMAN Oltóanyagtermelő és Kutató Intézet lB-NRbS kódjelű terméke.) f) A kromogén (orto-fenilén-diamin, OPD) kiszerelése A kereskedelemben beszerezhető OPD-t 1:8 súlyarányban laktózzal homogenizáljuk, majd 180 mg-onként kapszulákban töltjük. Egy kapszula OPD tartalma fentiek szerint 20 mg. g) Hidrogénperoxid szubsztrát A szubsztrát gyári készítmény, tablettázott karbamid peroxid. Alkalmazható pl. a Kőbányai Gyógyszerárugyár Hyperol gyártmánya. h) A progeszteron standardok készítése A progeszteron (SERVA) 0,3 /tmol/ml koncentrációjú alkoholos törzsoldatából alkohollal, majd hígító pufferrel (lásd i) pont) 0,1; 0,3; 1,0; 3,0; 10 és 30 pmol/ml koncentrációjú hígításokat készítünk, melyeket 0,5—0,5 ml térfogatban liofilizálunk. Felhasználás előtt a standardok tartalmát 0,5—0,5 ml desztillált vízzel rekonstituáljuk és tartalmukból 100—100 /il-t mérünk a csövekbe. i) A hígítópuffer (0,1% zselatint tartalmazó puffereit fiziológiás konyhasó oldat, PBS, pH = 7,1) összetétele NaCl 7,2 g KH2P04 0,43 g Na2HP04 X 2H20 1,44 g • Mertiolát 0,1 g Zselatin 1,0 g Desztillált víz ad 1 liter j) A szubsztrát puffer (citromsav-foszfát puffer, pH = 5.0) összetétele Na2HP04 X 2H20 11,2 g Citromsav 5,6 g Mertiolát 0,1 g Desztillált víz ad 1 liter k) A progeszteron meghatározás menete 40—40 /d emberi szérum mintából a progeszteront 1:25 térfogatarányban adott petroléterrel (40—70 °C forrponthatárú) kinyerjük, majd a vizes fázis kifagyasztása után az axtraktumból 1—1 ml-t üvegcsőben beszárítunk. A csövek tartalmát 100 /ti hígító pufferben oldjuk, 5 sec keveréssel. A progeszteron standardok bemérést a h) pont szerint végezzük. A csövekbe 100—100 /ti különböző standard oldatot mérünk, így azok 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1,0; 3,0 pmol progeszteront tartalmaznak. Az előhígított konjugátumból (lásd c) pont) további 1:200 térfogatarányú hígítást készítünk (véghígítás 1/20000) 0,5 térfogatszázalék normál nyúl-szérumot tartalmazó hígító pufferrel, és minden csőhöz 100 /ti konjugátumot adunk, majd a csöveket kémcsőkeverővei megkeverjük (5 sec). A liofilizált anti-progeszteron antitestet (lásd b) pont) felhasználás előtt hígító pufferben feloldjuk, 200 ni szérum/ ml oldószer arányban. Az oldatból a vak érték meghatározását szolgáló csövek kivételével a többi csőhöz 100—100 /t1-t adagolunk, a csövek tartalmát vortex rendszerű keverővei összerázzuk (5 sec). Az így összeállított csöveket 37 °C-os vízfürdőben 60 percig inkubáljuk. Eközben a liofilezett anti-nyúl IgG birkaszérumot (lásd d) pont) desztillált vízzel rekonstituáljuk, majd 9 súlyszázalék PEG 6000-t (Fluka) tartalmazó hígító pufferrel 1:40 térfogatarányban tovább hígítjuk, és az így elkészített oldatból 1—1 ml-t adunk valamennyi csőhöz. A csöveket szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd a kötött konjugátumot centrifugálással kiülepítjük, a szabad konjugátumot dekantáiással eltávolítjuk. Az anti-progeszteron antitesthez kötött progeszteron- HRP mennyiségét a csapadék HRP enzimaktivitásának mérésével határozzuk meg. 50 ml szubsztrát pufferben feloldjuk egy kromogén kapszula (lásd d) pont) tartalmát. 50 ml desztillált vízben feloldunk egy karbamid peroxid tablettát, majd az oldatból 500 /tl-t adunk a kromogén oldathoz. (Alkalmazhatunk H202 oldatot is, ekkor az 50 ml OPD oldathoz 0,088 /tmol H202-t mérünk.) A kész szubsztrát oldatból 1—1 ml-t mérünk a csövekhez, majd szobahőmérsékleten, fénytől elzárva 60 percig inkubáljuk. Az inkubációs idő lejárta után a csövekhez 0,25—0,25 ml 6 n kénsavat adunk, így állítjuk le az enzimreakciót. A kémcsőben esetleges felkeveredett polietilénglikolt rövid, 2 perces centrifugálással ülepítjük, a felülúszó fényelnyelését (OD) 492 nm-en spektrofotometriásán meghatározzuk. 1. Értékelés A felülúszó OD értéke a csapadék enzimaktivitásával arányos, és fordítottan arányos a mintában eredetileg jelenlévő, meghatározandó progeszteron mennyiségével. Az értékeléshez először az ismert progeszteron tartalmú standardokkal nyert OD értékek felhasználásával kalibrációs görbét készítünk. A görbéről a minta progeszteron tartalma a mért OD érték alapján leolvasható. Az eljárás vizuális értékelést is lehetővé tesz, a magas/alacsony érték diszkriminálása a standard minták alapján lehetséges. 2. példa Progeszteron meghatározása szarvasmarha szérumban A progeszteron kivonását a szárúm mintákból 1:25 térfogatarányú petroléterrel (40—70 °C) végezzük. A vizes fázis kifagyasztása után az extraktumból 2 ml-t üvegcsőben beszárítunk, majd a párlási maradékot 100 /ti hígító pufferben vortex keveréssel (5 sec) oldjuk. A meghatározást a továbbiakban az emberi szérumra leírt 1. példa k—1. pontjainak megfelelően végezzük. 3. példa Szarvasmarha tej-progeszteron koncentrációjának meghatározása a) Progeszteron meghatározás extrakció után, zsírtalanított tejmintákból A tejmintát 4 °C-on centrifugáljuk, majd a felülúszó zsírréteget kanállal eltávolítjuk, és az alsó, zsírban szegény fázisból 300 /(.1-t extrakciós csőbe mérünk. Az így bemért csövekhez 7,5 ml petrolétert adunk, és rázógépen szobahőmérsékleten 30 percig extraháljuk. A vizes fázist lefagyasztva a felülúszó petroléteres fázisból 2 ml-t üvegcsőbe mérünk és bepároljuk. Az extraktumok száraz maradékára 100 /d hígító puffert pipettázunk és keverés után a progeszteron koncentrációját az 1. példa k—1. pontjai szerint meghatározzuk. A leírt módszerrel reagenscsövenként 80 /d zsírtalanított tejminta hormontartalmát mérjük. b) Progeszteron meghatározás extrakció nélkül teljes tejmintákból (Direkt módszer) Az elegytej mintákból homogenizálás után 75 /tl-t 425 /ti desztillált vízzel 500 /tl-re kiegészítjük, majd 80 °C-os vízfürdőn 30 percig előinkubáljuk. Az így előkészített 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
