190425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-szubsztituált-2-piridil-indol-származékok és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 190 425 2 rülbelül 0,05-50 mg/kg, különösen körülbelül 0,1-25 mg/kg. A tromboxán-szintetáz enzim in vitro gátlását Sun módszerével [Biochem. Biophys. Res. Comm., 74., 1432. (1977.)] határozhatjuk meg. Ez a kísérleti módszer az alábbi. C,4-Arachidonsavat olyan enzimkeverék preparátummal inkubálunk, amely juh ondóhólyag oldhatóvá tett és parciálisán tisztított prosztaglandinciklooxigenázból és lízisnek alávetett emberi vérlemezkék tromboxán-szintetázának nyers mikroszóma-készítményéből áll. A pufferben vagy szükség esetén kismennyiségű etanolban feloldott vizsgálandó vegyületet az inkubált közeghez adjuk. Az inkubációs periódus (30 perc) végén a prosztaglandin E2-t (PGE2) nátrium-bór-hidrid hozzáadásával prosztaglandin F2a és F2ß keverékévé [PGF2(a + ß)] redukáljuk. A radioaktív termékeket és a szubsztrátum fölöslegét etil-acetáttal extraháljuk, és az extraktumot szárazra pároljuk. A maradékot acetonban feloldjuk, vékonyrétegkromatográfiás lemezekre felcseppentjük és toluol, aceton és jégecet 100 : 100 : 3 térfogatarányú elegyével kromatografáljuk. A radioaktív zónákat lokalizáljuk. A tromboxán B2(TxB2) és PGF2(a+ß) zónáit folyadékok meghatározására készített szcintillációs csőbe visszük és meghatározzuk a beütések számát. A TxB2/PGF2(a +ß) hányadost a vizsgálandó vegyület mindegyik koncentrációjának az esetében kiszámítjuk, és grafikusan meghatározzuk az IC50- értékeket. Ez az érték a vizsgálandó vegyület olyan koncentrációja, amelynek az esetében a TxB2/PGF2(a + ß) hányados a kontroll érték 50%ára csökken. A prosztaglandin-ciklooxigenáz in vitro hatását a Takeguchi és munkatársai által leírt módszer [Biochemistry, 10., 2372. (1971.)] egy módosított változata szerint határozzuk meg. A módszer az alábbi. Prosztaglandint szintetizáló enzimpreparátumként juhok liofilizált ondóhólyag-mikroszómáit használjuk. A C14-arachidonsav PGE2-vé történő átalakulását mérjük. Az inkubált közeghez hozzáadjuk a pufferben vagy szükség esetén kismennyiségű etanolban feloldott, vizsgálandó vegyületet. A prosztaglandinokat extraháljuk és vékonyrétegkromatográfiásan elválasztjuk. A lemezeket megvizsgáljuk, a PGE2-nek megfelelő radioaktív zónákat folyadékok meghatározására készített szcintillációs csőbe visszük és meghatározzuk a radioaktivitásukat. A gátlás IC50-értékeit grafikusan határozzuk meg. Ez az érték a vizsgálandó vegyület olyan koncentrációját jelenti, amely a szintetizált PGE2 mennyiségét 50%-kal csökkenti. A prosztaciklin(PGI2)-szintetázra gyakorolt in vitro hatást Sun és munkatársainak a módszerével [Prostaglandins, 14., 1055. (1977.)] határozzuk meg az alábbi módon. C14-Arachidonsavat olyan enzimkeverékben inkubálunk, amely juh ondóhólyag oldhatóvá tett és parciálisán tisztított prosztaglandin-ciklooxigenázból és szarvasmarha aorta mikroszóma-frakciójának nyers PGI2-szintetázából áll. Az inkubált közeghez hozzáadjuk a pufferben vagy szükség esetén kismennyiségű etanolban feloldott vizsgálandó vegyületet. Az elegyet lOOmmólos trisz-HCI pufferben (pH = 7,5) 30 percen át inkubáljuk 37 °C-on, majd 3-as pH-értékre savanyítjuk és etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot szárazra pároljuk, a maradékot acetonban feloldjuk, vékonyrétegkromatográfiás lemezekre felvisszük és a Sun és munkatársai által leírt oldószereleggyel kromatografáljuk. A radioaktív zónákat detektorral lokalizáljuk. A 6-keto-PGF,a-nak (a prosztaciklin biotranszformációjának stabilis végterméke) és a PGE2-nek megfelelő zónákat folyadékok meghatározására készített szcintillációs csőbe visszük és meghatározzuk a radioaktivitást. A ó-keto-PGF^/PGEí hányadost a vizsgálandó vegyület összes koncentrációjának az esetében kiszámítjuk. A gátlás IC50-értékét grafikusan határozzuk meg. Ez az érték a vizsgálandó vegyület olyan koncentrációja, amely a 6-keto-PGF!a/PGE2 hányadost a kontroll érték 50%-ára csökkenti. A szintézis gátlását és a tromboxán plazmaszint csökkentését in vivo patkányokon vizsgáljuk a vizsgálandó vegyület beadásával [Tai és munkatársainak a módszerével, Annal. Biochem., 87., 343. (1978.) és a Salmon által leírt módon, Prostaglandins, 15., 383. (1978.)] az alábbiak szerint. Patkányokat a vizsgálandó vegyülettel vagy hordozóanyaggal kezelünk és 2 órával később intravénásán 0,5 mg/kg Ionophor A 23 187-et injektálunk beléjük. 2 perccel az Ionophor beadása után az állatoktól analízis céljából vért veszünk. Mindegyik plazmapróba meghatározott mennyiségében radioimmun meghatározással meghatározzuk a tromboxán B2-t és további ugyanilyen mennyiségekből a 6-keto-PGF,a-t, a tromboxán A2, illetve a prosztaciklin (PGI2) stabilis metabolitjait. Az (I) általános képletű vegyületek nagyon hatásos és szelektív tromboxán-szintetáz inhibitorok. A hatásos és az annál magasabb dózis-szintek esetén jelentősen nem gátolják sem az előnyös prosztaciklin-szintetáz-, sem a prosztaglandin-ciklooxigenáz-enzimrendszert. A prosztaciklin-szint meglepő módon szignifikánsan megnő. Egy (I) általános képletű vegyület, például az 1 -(7-karboxi-heptil)-3-metil-2-(3-piridil)-indol ICS0-értéke tromboxán-szintetáz gátlás esetén 1,2- 10“8 mól, míg a prosztaciklin-szintetáz és a prosztaglandin-ciklooxigenáz gátlásakor az IC50- érték több nagyságrenddel nagyobb, azaz körülbelül 1 • 10“4 mól. A tromboxán-szintetáz gátlásakor az IC50-érték l-(5-karboxi-pentil)-5-(2-karboxi-etil)-3-metil-2- (3-piridil)-indol esetén 2 • 10“8 mól, l-(4-karboxibenzil)-3-metil-2-(3-piridil)-indoI esetén 5 • 10“8 mól, 1 -(5-karboxi-pentil)-5-klór-3-metil-2-(3-piridiI)-indol esetén 1 • 10“9 mól, l-(5-karbamoilpentil)-5-klór-3-metil-2-(3-piridil)-indol esetén 1 ■ 10“8mól, l-[2-(4-karboxi-fenoxi)-etil]-3-metiI-2- (3-piridil)-indol esetén 2,6 • 10“8 mól és í-[2-(4-karboxi-fenil-tio)-etil]-3-metil-2-(3-piridil)-indol-hidroklorid esetén 5,8 • 10“8 mól. Az 1 -(7-karboxi-heptil)-3-metil-2-(3-piridil)indol és az l-(5-karboxi-pentil)-5-klór-3-metil-2-(3- piridil)-indol mint a találmány szerinti eljárással előállitható vegyületek képviselői patkányokon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
