190358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enduracidi előállítására
1 190 358 2 A találmány tárgya eljárás enduracidin előállítására. Részletesebben, ez a találmány módszert szolgáltat enduracidin előállítására, amely módszer enduracidin kiválasztó képességgel vagy m-fluoro- DL-tirozin rezisztenciával vagy mindkét tulajdonsággal rendelkező, Streptomyces nemzetséghez tartozó, enduracidin-termelő mikroorganizmus tenyésztéséből, majd miután az enduracidin tápközegben jelentősen felhalmozódott, annak kinyeréséből áll. A találmány tárgya továbbá új, Streptomyces nemzetséghez tartozó, enduracidin-termelő mikroorganizmus, vagy ennek hasonló tulajdonsággal bíró, biológiailag tiszta tenyészete. Az enduracidin (más néven enramicin) Grampozitiv baktériumok elleni széles antibakteriális spektrumú antibiotikum, amely polipeptid-típusú antibiotikum többek között takarmány-kiegészítőként használható. Enduracidin a közös neve az (I) általános képletű enduracidin-analógoknak és ide tartoznak az enduracidin A, B, C és D. Az R csoport jelentése enduracidin A esetén: (CH3)2= =CH — (CH2)4=CHCH—CH—, B esetén: C2H5—CH(CH3)—(CH2)4—CH=CH—CH= = CH—, C esetén: 11 szénatomos zsírsavmaradék és D esetén 14 szénatomos zsírsavmaradék. Ezek között az enduracidin A és B a mikroorganizmusok által termelt enduracidin fő komponensei, ezek kémiai szerkezete jól ismert (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 6 (1970); Central Patent Index, Basic Abstract Journal, Section B: 42 389 R-BCD/R 24 = Japanise Patent Publication 7 017 158). Az enduracidin előállítására eddig ismert módszer a Streptomyces fungicidicus B-5477 (IFO 12 439; ATCC 21 013) és a Streptomyces fungicidicus B-5477-m (IFO 12 440; ATCC 21 014) törzsek felhasználásán alapul [3 786 142. számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Journal of Antibiotics, 21, 126 (1968)]. Széleskörű tanulmányt folytattunk abból a célból, hogy hatásosabb enduracidin-termelő mikroorganizmusokat nyerjünk, és úgy találtuk, hogy az az enduracidin-termelő mikroorganizmus, amely enduracidin-kiválasztó képességgel vagy m-fluoro- DL-tirozin rezisztenciával, vagy mindkét tulajdonsággal rendelkezik, a többszörösét képes termelni a szülőtörzs termelésének. A találmány szerint alkalmazható mikroorganizmusokról az alábbiakban adunk konkrétabb ismertetést. Az ismert enduracidin-termelő törzsek által termelt enduracidin legnagyobb része sejten belül halmozódik fel, akár folyékony, akár szilárd tápközegben történik a tenyésztés. Az említett enduracidin-kiválasztó mikroorganizmusok viszont olyanok, amelyek kiválasztják vagy szilárd táptalajon a telepek közé bocsátva diffundálják az enduracidint ugyanolyan feltételek között, amelyek között a szülőtörzsek egyáltalán nem választanak ki vagy nem diffundálnak ki enduracidint. Az enduracidin-kiválasztó mutánsok például úgy nyerhetők, hogy a spórákat vagy micéliumfragmenseket, amelyeket hagyományos módon (pl. UV-besugárzással, N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidin-kezeléssel, röntgenbesugárzással) mutációs kezelésnek vetettük alá, húsleves-agaron szélesztünk olyan módon, hogy egy 9 cm-es lemezen tíz vagy néhányszor tíz telep képződjék. Amikor a telepek megfelelően növekednek, azaz mintegy 4-6 nap tenyésztés után 28 °C hőmérsékleten, Bacillus subtilis PCI 219 tesztorganizmus spóráit tartalmazó lágy agar réteggel fedjük le az egyes lemezeket. Az így lefedett lemezeket 37 °C-on 16 órán át inkubáljuk, és alkalmanként találunk olyan telepeket, amelyek maguk körül növekedés-gátlási zónákat alakítanak ki. Az így nyert mutánsok tehát enduracidin-kiválasztó tulajdonságúak. Az ilyen mutánsok gyakorisága 3 telep 10 000 telep közül, ha a mutációs kezelés ultraibolya besugárzással történt. Az így nyert enduracidin-kiválasztó mikroorganizmusok a szülőtörzshöz viszonyítva több enduracidint termelnek. Különösen szervetlen foszfáttal kiegészített tápközegen az ilyen mikroorganizmusok enduracidin-termelése eléri a szülőtörzsek termelésének kétszeresét. Ilyen előnyösen használható törzs pl. a Streptomyces fungicidicus GAB-453 törzs (IFO 14 036; FERM p-5728; ATCC 31 729). Az m-fluoro-DL-tirozin rezisztens mikroorganizmusokat viszont a következő módon nyerjük : A B-5477 szülőtörzs nem képes nőni minimál agar táptalajon, amelyet 3 mikrogramm/ml koncentrációban m-fluoro-DL-tirozinnal egészítettünk ki. A minimál táptalaj összetétele: 1 % glükóz, 0,2% ammóniumszulfát, 0,1 % káliumdihidrogénfoszfát, 0,2% kalciumkarbonát, 1 ppm vas (II) szulfát, 1 ppm mangánklorid, 1 ppm cinkszulfát, 2% agar. Azokat a mikroorganizmusokat, amelyek az említett 3 mikrogramm/ml vagy nagyobb koncentrációban m-fluoro-DL-tirozint tartalmazó minimál agar táptalaj lemezen növekedni képesek, akár a szülőtörzsek spontán mutációjával, akár a szülőtörzsek hagyományos mutációs kezelésének eredményeként alakultak ki, m-fluoro-DL-tirozin rezisztens mutánsoknak nevezzük. Nagy termelékenységű enduracidin-termelő mikroorganizmusként azok a legelőnyösebbek, amelyek 60-200 mikrogramm/ml m-fluoro-DL-tirozint tartalmazó minimál agar táptalajon is képesek megfelelően nőni. Ilyen mikroorganizmusokat úgy nyerhetünk, ha 60-200 mikrogramm/ml m-fluoro-DL-tirozint tartalmazó minimál táptalajt a szülőtörzs kezeletlen vagy mutagén kezelésnek alávetett spóraszuszpenziójával inokulálunk, majd az inokulált táptalajt 28 °C-on 5-7 napig inkubáljuk, és a telepeket izoláljuk. Mutagénként az UV sugárzáson kívül számításba Jöhetnek egyéb hagyományos mutagének is, mint pl. az N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidin, metilmetánszulfonsav vagy röntgensugárzás is. Az m-fluoro-DL-tirozin rezisztens törzsek nyerésének gyakorisága általában 0,00001-0,0001% között van. Az így nyert m-fluoro-DL-tirozin rezisztens törzsek legtöbbjének enduracidin-termelőképessége mintegy kétszerese a szülőtörzsének. Az így nyert, előnyösen alkalmazható törzsre példa a Streptomyces fungicidicus Emt 36-3 törzs (IFO 14 037; FERM P-5729; ATCC 31 730), amelyet a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
