190207. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin származékok előállítására
1 190 207 2 b) HF-os hasítás Az eljárás megegyezik az 1. példa b) pontjában leírtakkal. A liofilizálás után kapott anyag súlya 980 mg (82%). c) Gélkromatográfia A nyerstermék további tisztítását Sephadex G25 oszlopon végezzük az 1c) pontban leírt körülményeket alkalmazva. Termelés: 576 mg (49%). d) Preparatív HPLC Az eljárást az 1. példa d) pontjában leírtakhoz hasonlóan végezzük, azzal a különbséggel, hogy az egyensúly beállítását 10% metanol és 90% 20%-os ecetsav keverékével végezzük. A gélkromatográfiával tisztított anyagot először 10% metanol - 90% 20%-os ecetsav és 25% metanol - 75% 20%-os ecetsav lineáris gradiensével eluáljuk az oszlopról, majd ezt követően 25% metanol - 75% 20%-os ecetsav és 40% metanol - 60% 20%-os ecetsav lineáris gradiensét alkalmazzuk. Az oldatok térfogata minden esetben 150-150 ml. A frakcionálás egyéb körülményei megegyeznek az ld) pontban leírtakkal. A liofilizált végtermék súlya 448 mg (38%. Rj: 0,12; Rf: 0,7; Rf: 0,24; Rf: 0,87 Aminosav analízis: Ser 0,87; Glu 2,05; Pro 1,03; Gly 2,13; Tyr 0,92; Phe 1,00; His 0,95; Trp 0,81. Op.: 182 °C [<x]d = -21,0° (c = 1, 0,2 n ecetsav) A kapott termékből a sósavas sót az alábbi módon állítjuk elő: 60 mg (0,05 mmól) [Phe7,Gln8]-gonadoliberint feloldunk 2 ml 0,5 n sósavban, majd az oldatot liofilizáljuk. A száraz maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük. Az így kapott [Phe7,Gln8]gonadoliberin-HCI súlya 62 mg. Op.: 233 °C (bomlik). 8. példa [Trp7,Gln8,desGly10]-gonadoliberin-etilamid M : 1220 előállítása a) Boc-Gln-Pro-NH-C2Hs M : 370 1,0 g (7 mmól) prolin-etilamidot feloldunk 15 ml dimetil-formamidban, a pH-t trietil-aminnal 8-ra állítjuk, majd 3,2 g (8,4 mmól) Boc-Gln-ONP 15 ml dimetil-formamidban készült oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet keverés közben szobahőmérsékleten 48 órán át állni hagyjuk, miközben a pH-t ellenőrizzük és szükség esetén 8-ra állítjuk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, az olajos maradékot feloldjuk vízben, majd éterrel mossuk. A vizes fázist vákuumban bepároljuk, majd megszárítjuk. A kapott termék súlya 1,93 g (74,5%) Rf: 0,76. b) H-Gln-Pro-NH-C2Hí ■ TFA M: 367 (TFA só) 1,9 g (7,2 mmól) Boc-Gln-Pro-NH-C?H5-ot feloldunk 10 ml trifluor-ecetsavban, majd keverés közben 20 percig szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük és vákuumban szárítjuk. Ily módon 1,52 g (58%) higroszkópos anyagot kapunk. Rf: 0,45; kRf: 0,43. Md = -34,8° (c = 1, metanol) c) Boc-Trp-Gln-Pro-NH-C2H, M:557 500 mg (1,85 mmóljk H-Gln-Pro-NHC2H5-TFA sót 10 ml DmF-ban oldunk, majd a pH-t trietil-aminnal 8-ra állítjuk. Ezt követően 608 mg (2 mmól) Boc-Trp 10 ml DMF-ban készült oldatát és 620 pl (4 mmól) N,N'-diizopropil-karbodiimidet adunk az oldathoz. A reakcióelegyet 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot etil-acetátban feloldjuk, és éterrel hígítjuk. A kicsapódottk Boc-Trp- Gln-Pro-NH-C2Hs-ot szűrjük, éterrel mossuk, majd szárítjuk. A termelés 740 mg (72%). Rr2: 0,75; R,3: 0,38. d) H-Trp-Gln-Pro-NH-C2Hs■ TFA M : 554 (TFA só) 700 mg (1,25 mmól) Boc-Trp-Gln-Pro-NHC2H5-ot feloldunk 15 ml trifluor-ecetsav és diklórmetán 1:1 arányú keverékében. Az oldatot keverés közben 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd vákuumban bepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A szilárd anyagot szűrjük és szárítjuk. Az így kapott 500 mg nyers terméket szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk etil-acetátpiridin-ecetsav-víz 47:20:6:11 arányú elegyével, a 2. példa d) pontjában leírttal megegyező körülmények között. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 360 mg (52%) peptidet kapunk. Rj: 0,46; Rf: 0,18. Op.: 119-123 °C. [a]2D° = -4,8° (c = 0,1, 0,1 n HC1) e) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-HN-C2H5 M: 613,7 350 mg (0,76 mmól) H-Trp-Gln-Pro-NH-C2H5-ot DMF-ban oldunk és 104 mg (0,8 mmól) Boc- Gly-nel reagállatjuk a c) pontban ismertetett módon. így 375 mg (81 %) kristályos anyagot kapunk. R3: 0,88; Rf: 0,82; Rf: 0,61. 0 H-Gly-Trp Gln-Pro-NH-C2Hs TFA M: 609,6 (TFA só) 375 mg (0,6 mmól) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHC2H5-ról a védőcsoportot a d) pontban ismertetett körülmények között távolítjuk el. Ily módon 285 mg (76%) fehér, porszerű anyagot kapunk. Rf: 0,08; R;3: 0,16; Rf: 0,67; Rf: 0,28. g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHC2//5 M: 1216,4 286 mg (0,4 mmól) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H, pentapeptid-hidrazidot reagállatjuk 243,8 mg (0,4 mmól) H-Gly-Trp-G!n-Pro-NH-C2H5-dal az 5. példa m) pontjában ismertetett módon. A Sephadex-kromatográfia után gyűjtött és liotílizált frakció súlya 252,9 mg (52%). R': 0,26: Rf: 0,32. Aminosav analízis: Ser 0,87; Glu 2,02; Pro 0.91 ; Gly 1,00; Tyr 1,12; His 1,05; Trp 1,80. Op.: 179 180 °C. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 85 8
