190207. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin származékok előállítására
1 . 190 207 2 Z-Leu-pentaklórfenilészter 65 ml kloroformban készült oldatát adjuk, és éjszakán át keverjük. Másnap a reakcióelegyet 1 n sósav oldattal, telített nátrium-klorid oldattal, majd 2n ammónium-hidroxid oldattal, végül ismét telített nátrium-klorid oldattal ! extraháljuk. A kloroformos oldatot vízmentes nát- j rium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepá- ] roljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, a szilárd ; anyagot szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. A nyers termék súlya 4,6 g (81%). j) H-Leudn-Pro-NHEt-HBr M: 465,5 Az előző pontban leírtak szerint kapott Z-Leu- Gln-Pró-NHEt tripeptidről további tisztítás nélkül távolítjuk el a védöcsoportot. Feloldjuk 10 ml jégecetes hidrogén-bromid oldatban, majd 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. 100 ml vízmentes éterrel elporítjuk, szűrjük, majd a gyengén sárga, porszerü anyagot exszikátorban szárítjuk. Halványsárga higroszkópos anyagot kapunk, melynek súlya 3,54 g (76%). R* : 0,42 j k) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 631,74 2,33 g (5 mmól) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.rHBr tripeptid sót oldunk 5 ml dimetil-formamidban, majd 0 "C-ra hütjük, és 0,70 ml (5 mmól) trietil-amint és 2,57 g (5 mmól) Boc-D-Phe-pentaklór-fenilészter 10 ml dimetil-formamidos oldatát adjuk hozzá. Az oldat pH-ját ezután trietil-aminnal 7 és 8 közé állítjuk, majd az oldatot szobahőmérsékleten 48 órán át keverjük, miközben pH-ját trietil-aminnal semlegesen tartjuk. Az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk, és tízszer 10 ml 0,1 M ammónia oldattal mossuk. A kloroformos oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A visszamaradó olajat éterrel el lehet porítani. A szűrt és szárított nyers termék súlya 2,81 g (89%); további tisztítás nélkül távolítjuk el róla a védőcsoportot. l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt■ TFA M : 645,65 1,26 g (2 mmól) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt tetrapeptidet feloldunk 10 ml trifluor-ecetsavban, majd szobahőmérsékleten 20 percig keverjük. A TFA-t vákuumban gyorsan eltávolítjuk, majd a maradékot éterrel elporítjuk és szűrjük. A szárított anyag súlya 1,19 g (92%). R*: 0,72; Rj? : 0,9; Rr7: 0,65 m) Glp-His- Trp-Ser- Tyr-DPhe-Leu-Gln-Pro-NHC2Hs M: 1198 286 g (0,4 mmól) az 5. példa g) lépésében előállított Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 pentapeptidhidrazidot oldunk 10 ml DMF-ban, - 10 °C-ra, hűtjük, és keverés közben 0,27 ml 6n sósavat, majd | 30,2 mg nátrium-hitrit tömény vizes oldatát csepegtetjük hozzá. 5 perc elteltével hozzáadjuk 258 mg (0,4 mmól) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt-TFA tetrapeptid 1 ml DMF-ben 0,27 ml TEA jelenlétében készült - 10 °C-os oldatát. A reakcióelegyet szükség esetén TEA-val semlegesre állítjuk, majd 1 órán át - 5 °C-on, további 1 órán át 0 °C-on keverjük, végül szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni. Ezt követően vákuumban bepároljuk. A bepárlás után kapott olajat 5 ml 0,2 n ecetsavban oldjuk és Sephadex G25 oszlopon (2 x 95 cm) 0,2 n ecetsav oldatban kromatografáljuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. Termelés: 298 mg (62%) Rj: 0,74; Rf5: 0,65; Rf: 0,37; R®: 0,80 Aminosav analízis : Ser 0,89 ; Pro 0,97 ; Leu 1,00 ; Phe 0,99; Glu 1,98; Gly 1,01; Tyr 1,03; Trp 0,91. 6. példa [Phe7, Leu8]-gonadoliberin előálítása a) Szintézis 0,62 g (0,5 mmól) benzhidril-amin-HCl gyantából [0,8 mekv./g] kiindulva az 1. példa a) pontjában leírt módon szintetizáljuk a Glp-Hís(Tos)-Trp- Ser(OBzl)-Tyr(OBzI)-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2 dekapeptid-amidot. A kapott peptidgyanta súlya ' 1,31 g. ÄW: 0,69 g (92%) (h4 védett peptjd • 1 506) b) HF-os hasítás Az eljárás megegyezik az 1. példa b) pontjában leírtakkal. Az 50%-os ecetsavas szűrlet bepárlása, majd liofilizálása után kapott száraz maradék súlya 510 mg (87%). c) Gélkromatográfia A gélkromatográfiát Sephadex G25 oszlopon végezzük az le) pontban leírt körülményeket alkalmazva. A begyűjtött és liofilizált frakció súlya 363 mg (62%). d) Si02-kromatográfia A szilikagél kromatográfiát Kieselgel 60 gyantával töltött oszlopon (2 x 100 cm) végezzük. Az egyensúly beállítását és az eluálást «-butanol-ecetsav-víz-etilacetát = 1:1:1:1 oldószereleggyel végezzük. Az egyes frakciók anyagtartalmát 280 nmnél mért UV-elnyeléssel és TLC-vel az 5-ös oldószerelegyben, majd aminosavanalízissel vizsgáljuk. A tiszta [Phe7,Leu8]-gonadoIiberin súlya 299 mg (51%). R'f: 0,58; Rf: 0,39; R’: 0,62; R7f: 0,73 Aminosav analízis : Ser 0,91 ; Glu 0,97 ; Pro 1.07: Gly 2,12; Leu 1,00; Tyr 1,03; Phe 0,94; His 1,05. Op.: 175-178 °C. 7. példa [Phe7,Gln8]-gonadoliberin előállítása M: 1187' a) Szintézis 1,25 g (1 mmól) benzhidril-amin-HCl gyanún [0,8 mekv./g] diklór-metánban duz/as/tuíik két órán át, majd az 1. példa a) pontjában leirt módon szintetizáljuk a Glp-His(Tos)-Trp-Sei(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH, dekapeptidamidot. A kapott peptidgyanta súlya 2,9 u AVV 1,27 g (83%) (Mvédett pepiid : 1521) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
