190207. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin származékok előállítására
1 190 207 2 ecetsavés35% metanoi-65% 30%-os ecetsav lineáris gradiensével eluáljuk az oszlopról. A frakcionálás egyéb körülményei megegyeznek az 1/d pontban leírtakkal. A liofilizált végtermék súlya 380 mg (31%). Rp '. 0,66 Rf5:0,57 R*: 0,78 Aminosav-analízis: Glu 1,93; Gly 2,04; Pro 1,00; Tyr 0,98 ; Ser 0,93; Trp 1,86; His ,03 4. példa [Trp7,LeuB,desGIyNH2°]-gonadoliberin-etilamid előállítás M : 1198 a) Szintézis A szintézis első lépéseként BocPro-t kapcsolunk klór-metilezett polisztirol gyantához az irodalomból ismert és általánosan alkalmazott módszer szerint (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 86, 304 /1964/). Az így kapott Boc-Pro-gyantából [0,5 mekv/g] 2,0 g-ot (1 mmól) 2 órán át duzzasztunk diklór-metánban, majd az 1. példa a) pontjában ismertetett reakciónak megfelelően lépésenként kapcsoljuk a gyantához a megfelelően védett aminosavakat. Az utolsó ciklus után kapott Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp- Leu-Pro-nonapeptid gyanta súlya 3,02 g. AW: 1,02 g (83%) (Myédeu pepiid : I486) b) A védőcsoportok eltávolítása és a pepiid lehasitása a gyantáról Először a dinitro-fenil védőcsoportot hasítjuk le a hisztidinről a 3. példa b) pontjában ismertetett módon. Ezt követően a pepiidet hasítjuk le a gyantáról etil-amid formájában (Coy, D. H. et al., Biochemistry 13, 323-326 /1974/). E célból a védett peptidgyantára 15 ml etil-amint kondenzálunk, majd 0 °C-on 3 órán át keverjük. Az amin feleslegét N2-gáz segítségével elpárologtatjuk. Ezt metanolos, majd dimetil-formamidos mosás követi. A dimetilformamidos oldat bepárlása után kapott olajat éterben eldörzsöljük, és a csapadékot szűrjük. Az így kapott szilárd anyagot az 1. példa b) pontjában ismertetett módon kezeljük HF gázzal a védőcsoportok eltávolítása végett. E műveletek után 710 mg (59%) nonapeptid-etil-amidot kapunk. c) Gélkromatográfia A molekulaszűrést az 1. példa c) pontjában leírtakhoz hasonlóan végezzük, Sephadex G25 oszlopon, eluensként 30%-os ecetsavat alkalmazva. A gyűjtött és liofilizált frakció súlya 490 mg (41 %). d) Si02-kromatográfia A szilikagél-kromatográfiát a 2. példa d) pontjában ismertetett módon végezzük. Az aminosavtartalom alapján határozzuk meg a [Trp7,Leu8,desGIyNH[°]-Gn-RH-EA-nak megfelelő frakciót. A liofilizált anyag súlya 320 mg (26%). R): 0,61; R2: 0,42; R® : 0,75 Aminosav-analízis: Glu 0,96; Gly 0,97; Pro 0.95; Leu 1,00; Ser 0,89 ;1 Tyr 1,02; Trp 1,88; His 1,03 5. példa [D-Phe®, Gln8,desGlyNH[°]-gonadoliberin-etilamid előállítása M : 1198 a) BOC-His(DNP)-Trp-OMe M: 622,62 21,12 g (50 mmól) BOC-IIis(DNP)-OH-t feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, majd 0 °C-ra hütjük. Keverés közben hozzáadunk 10,32 g (50 mmól) dicíklohexil-karbodiimidet és 7,66 g (50 mmól) N-hidroxi-benztriazolt. Azelegyet 10 percig 0 cC-on keverjük, majd a kivált diciklohexil-karbarmdot kiszűrjük. 12,74 g (50 mmól) H-Trp-OMeHCl-ot feloldunk 70 ml dimetil-formamidban, és az oldatot 0 °C-ra hűtjük. Hozzáadunk 6,94 ml (50 mmól) trietilamint, majd 5 perc keverés után a kivált trietilamin-hidrokloridot kiszűrjük. A két oldatot egyesítjük, és éjszakán át 0 °C-on keverjük. Másnap a kivált DCU-t kiszűrjük, és az oldatot szárazra bepároljuk. A kapott olajat 500 ml etil-acetátban feloldjuk, és háromszor 100 ml jéghideg 1 mól-os kálium-hidrogén-szulfát oldattal, majd ötször 100 ml telített nátrium-hidrogénkarbonát oldattal, végül kétszer 100 ml 10%-os nátrium-klorid oldattal kirázzuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és szárazra bepároljuk. A kapott olajos anyagot petroléterrel elporítjuk, szűrjük és szárítjuk. Az így kapott kristályos anyag etil-acetátból petroléterrel átk ristályosítható. Termelés: 27,70 g (89%) Op. 119-122 °C [a]2,2 = + 14,1° (c= 1, DMF) Rf = 0,62; Rf = 0,41 b) H-His(DNP)~Trp-OMe-2HCl M: 522,49 (szabad bázis); 595,41 (-2HC1) 24,9 g (40 mmól) BOC-His(DNP)-Trp-OMe dipeptidet feloldunk 100 ml metanolban, és hozzáadunk 100 ml 4n metanolos sósav oldatot. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, mialatt a dipeptidészter-hidroklorid kikristályosodik Ezt kiszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. Termelés: 21,91 g (92%) Op. 198-202 °C [u]2d2 = 0,49° (c=l,DMF) Rf = 0,46; R? = 0,18 c) Glp-His-(DNP)~Trp-OMe M : 633,60 4,85 g (36,8 mmól) L-piroglutaminsavat. 7,58 g diciklohexil-karbodiimidet és 5,63 g N-hidroxibenztriazolt feloldunk 100 ml dimetil-formamidban. Az elegyet 10 percig 5-10 °C-on keverjük, majd a kivált DCU-t kiszűrjük. 20,84 g (35 mmól) H-His(DNP)-Trp- OMe-2HCl-t feloldunk 100 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz hozzáadunk 9,72 ml (70 mmól) trietil-amint. 5 perc keverés után a kivált trietilamin-hidrokloridot kiszűrjük. A két oldatot cgyesítjük és éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. / ! 5 i 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60 1 65
