190207. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin származékok előállítására
1 190 207 2 Az utolsó lépés után a Glp-His(Tos)-Trp- Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly peptidgyanta súlya 2,28 kg. AW: 1,05 g (66%) (Mvcdett pcptid ■ ^ 577) b) HF-os hasítás A gyantához 3 ml anizolt, 100 mg ditiotreitet adunk, majd 30 ml HF-ot kondenzálunk az elegyhez, és 0 °C-on 1 órán át keverjük. Ezt követően a HF-ot N2-áram segítségével eltávolítjuk, a maradékot abszolút éterben szuszpendáljuk, majd szűrjük. A szilárd maradékot 50%-os ecetsavval mossuk, és a szűrletet 37°C-on bepároljuk. Az így kapott HF- sót közvetlenül gélkromatográfiának vetjük alá c) Gélkromatográfia Az előző pontban kapott anyag tisztítását Sephadex G25 oszlopon (2,5 * 100 cm) végezzük, eluensként 50%-os ecetsavat alkalmazva. Az elválást 280 nm-nél mért UV-elnyeléssel és TLC-vel követjük. 15 ml/óra folyássebesség esetén a 300 ml-től 350 ml-ig terjedő frakciókat gyűjtjük és liofilizáljuk. Súly: 690 mg (55%). d) Preparatív HPLC Cjg-szilikagél LRP-1 (13-24 pm) (Whatman) preparatív HPLC oszlopot (2,5 x 45 cm) alkalmazunk. Az egyensúly kialakítását 25% metanol és 75% 30%-os ecetsav keverékével végezzük. Az egyensúly beállta után ebben az elegyben oldva viszünk fel 230 mg gélkromatográfiával tisztított anyagot. Az elúciót 25% metanol - 75% 30%-os ecetsav és 40% metanol - 60% 30%-os ecetsav lineáris gradiensével végezzük. Folyássebesség 2 ml/ perc, a nyomás 3,5 ■ 105 Pa. A frakciókat 280 nmnél detektáljuk, tartalmukat TLC-vel ellenőrizzük. A végtermékként kapott tiszta [D-Phe6, Gln8]GnRH súlya liofilizálás után 133 mg. Ez a teljes anyag mennyiségére vonatkoztatva 399 mg (32%) tisztított végterméknek felel meg. RJ = 0,76 R’ = 0,68 R‘ = 0,33 Rf7 = 0,93 R* = 0,83 Aminosav-analízis: Gly: 1,02; Pro: 0,95; Leu: 1,00; Phe: 1,02 Tyr: 1,01; Ser: 0,93; His: 0,99; Glu: 1,96 2. példa [D-Phe6, Trp7, Leu8]-gonadoliberin előállítása M: 1301 a) Szintézis 2,5 g (1 mmól) benzhidril-amin-HCl gyantából [0,4 mmól/g] kiindulva az 1. példa a) pontjában leírt módon szintetizáljuk a GIp-His(Tos)-Trp Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-DPhe-Trp-Leu-Pro-Gly-deka peptid-amidot. A kapott peptidgyanta súlya 3,8 g AW: 1,3 g (80%) (Mvédett pep,id : 1635) b) HF-os hasítás Az eljárás megegyezik az 1. példa b) pontjában leírtakkal. Az 50%-os ecetsavas szűrlet bepárlása, majd Iiofilizálása után kapott száraz maradék súlya: 965 mg (74%). c) Gélkromatográfia A gélkromatográfiát Sephadex G25 oszlopon végezzük az 1/c pontban leírt körülményeket alkalmazva. A begyűjtött és liofilizált frakció súlya 500 mg (38%). d) Si02~kromatográfia A szilikagél kromatográfiát Kieselgel 60 (230-400 mesh) (Merck) gyantával töltött oszlopon (2x 100 cm) végezzük. Az egyensúly kialakítását és az eluálást etilacetát-ecetsav-piridin-víz = = 30:6:20:11 oldószereleggyel végezzük, 8 ml/óra folyássebességet alkalmazva. Az egyes frakciók anyagtartalmát TLC-vel a 2-es oldószerelegyben, majd aminosavanalízissel vizsgáljuk. Az aminosavtartalom alapján a 470 ml-től 500 ml-ig terjedő frakciók felelnek meg a tiszta [D-Phe6,Trp7-Leu8]gonadoliberinnek. A peptid súlya 375 mg (29%). Rj :0,58 Rf2: 0,24, R8: 0,72 Aminosav analízis : Glu 0,97 ; Gly 0,99 ; Pro 1,02 ; Leu 1,00; Tyr 1,03; Phe 1,01; Ser 0,93; Trp 1,87; His 0,95 3. példa [Trp7, Gln8]-gonadoliberin előállítása M: 1226 a) Szintézis 2,5 g [1 mmól] benzhidril-amin-HCl gyantából [0,4 mekv./g] indulunk ki, és az 1. példa a) pontjában leírt eljárás szerint állítjuk elő a Glp- His(DNP)-Trp-Ser-(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro- Gly-NH2 dekapeptidet. A peptidgyanta súlya 3,62 g-AW: 1,12 g (76%) (Mvédett peptid • 1468) b) A védőcsoportok eltávolítása és a peptid lehasitása a gyantáról DNP (dinitro-fenil) védőcsoport lehasítása : A peptidgyantát 20 ml DMF és 1 ml propil-amin elegyében szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. Ezt követően a gyantát szűrjük, majd diklórmetánnal és etanollal mossuk. HF-os hasítás A dinitro-fenil védőcsoport eltávolítása után a pepiidet a gyantáról, illetőleg a védőcsoportokat a pepiidről az 1. példa b) pontjában ismertetett módszerrel távolítjuk el. A két lépés után nyert anyag súlya 0,8 g (65%). c) Gélkromatográfia Az eljárás menete azonos az I. példa c) pontjában leírtakkal. A begyűjtött és liofilizált peptid súlya 520 mg (42%). d) Preparatív HPLC Az eljárási a/ I. példa d) pontjában leírtakhoz hasonlóan végezzük, azzal a különbséggel, hogy az egyensúly kialakítását 18% metanol és 82% 30%-os ecetsav keverékével végezzük. A gélkromatográfiával tisztított anyagot 18% metanol - 82% 30%-os 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
