190134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mutagén anyagok jelenlétének és mennyiségének a meghatározására
2 190134 3 A találmány tárgya eljárás mutagén anyagok jelenlétének és mennyiségének a meghatározására. Az úgynevezett mulagenitási vizsgálatot a rákkeltő hatásúnak feltételezett anyagok előzetes vizsgálatára használják, mivel bakteriális mulagenitási vizsgálatokban megállapították, hogy az ismert rákkeltő anyagoknak legalább 90 százaléka mutagén hatású is. Biológiai mintákból megállapítható például a vizelet mutagén hatásából, hogy a vizsgált személy olyan mutagén anyagok hatásának volt kitéve, amelyek potenciálisan rák-veszélyt okoznak. Mutagén anyagok jelenléte megállapítható levegő-mintákban, víz és élelmiszer mintákban, és például a mutagén hatású növény védőszerek és egyéb hatóanyagok lehetséges jelenléte is kimutatható élelmiszerben. A mulagenitási vizsgálat egyre növekvő részét képezi a termékek törvény által előírt toxikológiai vizsgálatának. Ezeknek a vizsgálatoknak a legfontosabb használói közé tartozik jelenleg a gyógyszer- és vegyipar. A környezetvédelemmel és munkahelyi biztonsággal foglalkozó hivatalok létrehozták saját speciális területüket, mert általában több különböző vegyszert tartalmazó komplex mintákat kell vizsgálniuk. A fogyasztók védelmének törvényes fokozásával például az élelmiszerek és élelmiszer adalékanyagok is bekerülnek a mutagenitási vizsgalatok körébe. Ezeknek a mintáknak a vizsgálata problematikus lehet, mert az említett termékekben található növekedési faktorok hamis pozitív eredményeket okozhatnak. A szakirodalomban a mikrobiológiai fluktuációs vizsgálatot alkalmazzák a mulagenitás megállapítására. A fluktuációs teszt kétszintes vizsgálata a bakteriális mutagenitásnak, amely alkalmas mutagén anyagok alacsony, nem-toxikus koncentrációinak vizsgálatára. A vizsgálat első szintjén, mely 18-20 órát tart, lejátszódik (ha lejátszódik) a mutáció. Ezután 3 napos szelekció következik növekedési faktorok nélküli tápközegben. Mivel a vizsgálat folyékony közegben zajlik, ahol megkísérlik az összes eredeti mutáns izolálását, a fenti megkötésekből következik, hogy a vizsgálat végrehajtásához nagyszámú vizsgálati csőre van szükség. Minél több vizsgáló csövet használunk mintánként, annál nagyobb a valószínűsége, hogy az eredeti mutánsokat izolálni tudjuk, mindegyiket saját csövében. A mutánsok növekedésének megfigyelése pH-indikátor használatán alapszik, mivel a mutált sejtek savas erjesztési terméket választanak ki a szelektív táptalajon való növekedés közben. A mikrobiológiai fluktuációs vizsgálat egyike az eddig kifejlesztett legérzékenyebb mulagenitási vizsgálatoknak. Az AmeB-teszt, amely n legáltalánosabban használt bakteriális mulagenitási vizsgálat körülbelül 10-100- -szor ragyobb koncentrációban igényli a mutagén anyagot, hogy a fluktuációs teszttel összehasonlítható pozitív választ kapjuk. A fluktuációs teszt hátránya az anyagban levő mérgező- és növekedési faktorok hatásaival szembeni érzékenysége és ez az, amiért a vizsgálat sok munkál igényel. Legalább 51 csövet használnak egy mintához, és ha a minta toxikus tulajdonságait tekintve ismere len, az említett mintának nyolc különböző hígítására is szükség lehet, hogy elérjék a nem toxikus, de még mutagén koncentráció tartományt. Ilyen esetben a csövek teljes száma 400 is lehet mintánként. Az összes munkafázist beleszámítva, a vizsgálat végrehajtásira hígításonként (50 cső) körülbelül 30 pe'ere van szükség, ami tetemesen csökkenti a vizsgált minták számát. / következő napokon végrehajtandó mutagen'zálás és szelekció csak a hétfői és csütörtöki napokon teszi lehetővé a vizsgálat indítását, a hétvégeken való munkát el kell kerülői. A manuálisan végrehajtott mutagén vizsgálat hátránya a magas költség. A találmány szerinti eljárásban az osztódó sejt-populációkban léLrejövö sűrűség-változás által okozott turbidilásbeli változást agy megadott hullámhosszon függőlegesen mérő fotométerrel megállapított optikai-sűrűség változással mérjük, és a sejtek mennyiségét optikai sűrűség alapján határozzuk meg a szub-populációkban. Függőlegesen mérő fotométer segítségével lehetővé válik, hogy egy baktérium-tenyészetben optikai sűrűség alapján mérjük meg pontosan a sejtek számát, mivel a mérési ered menyeket nem befolyásolja a sejtek ülepedése vagy a folyadék térfogatának változása, A fotométer mellett a mérést végrehajthatjuk függőlegesen működő fluoriinélerrel, nefe’ométerrel, luminomélerrel vagy bármely más, a sejt-tenyészetek növekedésében beálló változásokat regisztrálni képes berendezéssel. Egy eredetileg egységes auxotróf sejttenyészet genetikusán differenciálódhat a műt,.gén anyag hatására auxotróf és prototróf szub-populációkra. A fotométer segítségével az említett populációknak esetleg egy közös küvetlában lejátszódó növekedésének megfigyelésével megtudhatjuk a növekedési göirbe időfüggéséböl például a minta mutagenitását, loxicitásál, a toxieitás természetét (bakterioszlatikus, baktericid), a mérgező anyagnak a vizsgálat során való lebomlását, valr mint ha vannak, a növekedési faktorok jelenlétét a mintában és az auxotróf és prototróf sejtek növekedési sebességét. Ezeknek a paramétereknek a megismeréséhez nincs szükség arra, hogy akár a mintába, akár a vizngáló organizmusba beavatkozzunk. A spontán mutációs frekvencia (az úgynevezett háttér) megállapításéhoz egy, a tőb-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
