190134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mutagén anyagok jelenlétének és mennyiségének a meghatározására
4 190 34 5 bi mintáknak megfelelő, de mutagénl nem tartalmazó mintára van szükség. A módszer működőképességét másik, ismert mutagént tartalmazó mintával erősíthetjük meg. A tanulmányozni kívánt ismeretlen anyagtól függően lehetőség van számos párhuzamos vizsgálatra és/vagy hígítás készítésére. Mikrobiológiai mutagenitási vizsgálatban mód van genetikailag pontosan jellemzett, egyszeresen jelzett aminosav-auxotróf baktérium-törzsek használatára. A mutáció által a genotípusban okozott változást fenotipusosan változott növekedési-faktor igényként detektáljuk, úgy a megfelelő típusú mutációt szenvedett sejtek az aminosav növekedési faktorok hatásától függetlenné válnak. A vizsgálat során az eredetileg genetikailag azonos baktérium-tenyészetet inutagének hatásának tesszük ki, melynek eredményeképpen a populáció egy része auxolrófról prototrófra mutál. Az ilyen módon megváltozott szub-populációk turbiditásának növekedését függőleges mérési módszerrel FP-901 fotométerrel észlelhetjük spektrofotometriásán szub-minimái tápközegben, mivel a folyadék térfogatának változása és a baktérium-sejtek ülepedése nem befolyásolja a mért elnyelési értékekei. Az FP-901 típusú fotométer például a nyilvánosságra hozott NSZK-beli szabadalmi bejelentés (2 451 769 számú) leírásban található. Ha az összes növekedési faktor aminosavakat elhasználták, csak a mutációt szenvedett sejtek képesek folytatni növekedésüket. Minél nagyobb a vizsgálat indukálásának pillanatában az indukált mutáns sejtek pupulációjáriak mérete, annál gyorsabban érnek el egy spektrofotometriásán mérhető sűrűséget. A vizsgálat kezdetétől a detektálás időpontjáig eltelt idő fordítottan arányos a mintában található mutagén aktivitással. A tenyészetek növekedésének az abszorpció alapján kapott görbéje, az úgynevezett növekedési görbe, a minLa mutagenitása mellett arról is informál, van-e növekedési faktor a mintában. A korábbi vizsgálatokkal összehasonlítva, a módszernek, a következők az előnyei: 1) Sebesség: vizsgálat eredményét kevesebb mint 24 óra alatt megkapjuk. Az Ames-teszt esetében erre 48, a fluktuációs teszt esetében 96 órára van szükség. 2) Kevesebb mintát és reagenst használ, mert a Lurbidometriás módszernél kisebb az össztérfogat. 3) Az anyagfelhasználás: A turbidometriás módszernél egy mintát egy küvetlában vizsgálunk, míg az Aines-Leszlnél legalább 6 Pelri-csészére van szükség, a fluktuációs tesztnél 150 csőre van szükség mintánként. 4) Munkafelhasználás: Az FD-901 rendszerrel az egész turbidomelriás módszert automatizálni lehet. A mintánkénti időszükséglet körülbelül 20 másodperc. Az Ames-tesztnél egy mintához legalább 20 perc kell, a fluktuációs tesztnél körülbelül másfél óra. 5) A kezdési időpontot szabadon választhatjuk meg a hét folyamán: A turbidometriás teszt időtartama kisebb, mint 24 óra, míg az Ames-teszthez szükséges 48-óra a hétfőtől szerdáig terjedő periódusra korlátozza a kezdési időpontot, a fluktuációs teszttel pedig csak hétfőn vagy csütörtökön lehet kezdeni, ha a hétvégén nincs munka. 6) Érzékenység: Elméletben a turbidomelriás módszer az elképzelhető legérzékenyebb módszere a bakteriális mulagenitás vizsgálatának. Ezzel a módszerrel még egy indukált revertánst is lehet datektálni. A nullás kontroll spontán reverziós szintje rendszerint kisebb, mint egy per minta. Egy indukált revertánst is lehet detektálni. A alapján detektálhatunk körülbelül 20 óra alatt, ha a G.T. (generációs idő) körülbelül 40 perc 7) A turbidomelriás mutagenitási teszt az egyetlen mutagenitási teszt, amelyben a vizsgálat kezdete és vége között is kaphatunk információt anélkül, hogy a mintát megzavarnánk. Az Ames tesztben lehetséges a minta akut toxieitásának meghatározása, de az megkétszerezi a vizsgálathoz szükséges munka mennyiségét. Másrészről a fluktuációs tesztben is történnek kísérletek a loxicitás kiküszöbölésére, és ehhez kiterjedt hígítási sorok szükségesek. A találmányt és részleteit részletesseben írjuk le az alábbiakban, a csatolt ábrákra való hivatkozással, ahol az 1-3 ábrák különböző növekedési görbéket mutatnak be, például elnyelési értékeket az idő függvényében, ahol az elnyelési értékeket a logaritmikus skálán ábrázoljuk. így a bakteriális mulagenitás turbidomelriás vizsgálata a mutagén által okozott differenciálódáson alapszik, azaz az eredetileg genetikailag egységes sejt-pupulációnak auxotróf és prolotróf szub-popuiációra való szétválásán, valamint ezen szub-populációk által a turbiditásban okozott változásnak a megfigyelésén. Ezekben a vizsgálatokban az E. coli WP2 (trp") és a Salmonella typhimurium (his~) vagy bármely elérhető aminosav-auxotróf, egyszeresen jelzett törzset használhatunk. A sejt-populációk növekedését és differenciálódását egy függőlegesen mérő FP-901 spektrofotométerrel figyeljük meg, ahol a folyadék-térfogat változása és a sejtek ülepedése nem érinLi az elnyelés, A = c in/a mérését, ahol A az olikai sűrűség, c az anyag abszorpciós koefficiense, m az abszorbeáló anyag összmennyisége, a fény útjára merőleges keresztmetszet rSuovaniemi, 0., „Performance and Properties of the Finnpipelte Analyzer System", Proceedings of the Second National Meeting on Biophysics and Biotechnology in Finland, 1976., 183-187. oldal, szer kosz telte Kairón to, A.-I,., Riihimaki, E. és Tarkka, P.; és Souva-5 10 15 20 25 31 35 41 45 50 55 60 65 4
