190129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karboxi-peptidáz b enzim elkülönítésére emlősők hasnyálmirigyéből
6 190129 7 át +4 °C-on állni hagytuk. Másnap a szuszpenziót 37 °C-ra melegítettük fel és 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartottuk. Ezután a szervszuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszót 60 °C-ra melegítettük és ezen a hőmérsékleten inkubáltuk további 20 percig, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges puffert és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 98,2 g ammónium-szulfátot adtunk. Mivel egy éjszakai állás alatt csapadék nem vált ki, az oldathoz - a pH=7,0-7,2-re állítása után - további 86,9 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk. A csapadékot kevés hideg (+4 °C-os) Tris-HCl pufferben (pH=7,0) feloldottuk és desztillált vízzel szemben sómentesre dializáltuk. Dialízis után az oldatot szűrtük, majd lefagyasztottuk. Kitermelés: 266 mg karboxipeptidáz B. Specifikus aktivitás: 63,2 pmól hippuril-L-arginin hidrolízise(perc)mg fehérje. 4. példa 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdarálón ledaráltunk, hozzáadtunk 250 ml 0,05 mó- 5 los Tris-HCl puffert (pH-7,0) és egy éjszakán át +4 °C-on állni hagytuk. Másnap a szuszpenziót 37 °C-ra melegítettük fel és 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartottuk. Ezután a szuszpenziót centrifugáltuk, a felül- 10 úszót 75 °C-ra melegítettük és ezen a hőmérsékleten inkubáltuk további 5 percig, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges puffert és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 66,9 g ammónium-szulfátot adtunk. Mivel egy éjszakai 15 állás alatt csapadék nem vált ki, az oldathoz - a pH=7,0-7,2-re állítása után - további 55,8 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk. A csapadékot kevés hideg (+4 °C-os) 20 Tris-HCl pufferben (pH=7,0) feloldottuk és desztillált vízzel szemben sómentesre dializáltuk. Dialízis után az oldatot szűrtük, majd lefagyasztottuk. Kitermelés: 34 mg karboxipeptidáz B. Specifikus aktivitás: 21,6 jumól 25 hippuril-L-arginin hidrolízise(perc)mg fehérje. 1. Táblázat Sertés hasnyálmirigy homogenizátum hőkezelési hőmérsékletének és idejének hatása a karboxipeptidáz B aktivitására Hőmérséklet (°C) Idő (perc) Osszak ti vitás (* 5egység/kg hasnyálmirigy) Összfehérje (mg/kg hasnyálmirigy) Specifikus aktivitás (egység/mg) 50 30 23 968 1 372 17.5 60 10 62 660 1 180 53.1 20 67 260 1 064 63.2 75 5 2 932 136 21.6 * Egy egység az az enziminennyiség, amely 1,0 /umól hippuril-L-arginin hidrolízisét katalizálja percenként pH=7,65-ön, 25 °C-on mérve. 5. példa 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdarálón ledaráltunk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. Másnap hozzáadtunk 250 ml 0,05 mólos acetát puffert (pH=5,0) és a szuszpenziót 60 °C-ra melegítettük fel és 20 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges vizet és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 274,8 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk, a csapadékot eldobtuk, a felülúszóhoz - a pH=7,0-7,2-re állítása után -232,9 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk. A csapadékot kevés hideg (+4 °C-os) Tris-HCl pufferben (pH=7,0) feloldottuk és desztillált vízzel szemben sómentesre dializáltuk. Dialízis után az oldatot szűrtük, majd lefagyasztottuk. Kitermelés: 360 mg karboxipeptidáz B. Specifikus aktivitás: 14,8 jumól hippuril-l.-arginin hidrolízise(perc)mg fehérje. 50 6. példa 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdará- 55 lón ledaráltunk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. Másnap hozzáadtunk 250 ml 0,05 mólos acetát puffert (pHz5,5), a szuszpenziót 60 °C-ra melegítettük fel és 20 percig ezen a hőmérsékleten 60 tartottuk, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges vizet és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 261,2 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk, a csapadékot eldobtuk, a felülúszóhoz - 65 a pH :7,0-7,2-re állítása után - 228 g ammó-5
