189734. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai készlet és alkalmazása dehidrogenázok és/vagy oxidázok kimutatására
1 189 7? 4 2 -TV, 5-nitro-TT és a 2-(3-metoxi-4-fenÜ)-5'{p-nitro- Ofenil)-3-fen3-tetrazólium-klorid. Ezekben az elnevezésekben afbetőjelzések jelentése a következő: NBT » 3,3 (3,3 -dimetoxi-4,4-bifenflén)-biszf2-{p-nitro-fenflV5-fenil-2H-tetrazólium-klorídJ, TNBT = 3,3 -(3,3'-dimetoxí-4,4 -biferiilén)-bisz(2,5- -p-nitro-feni]-2H-tetrazólium-klorid), MTT » 3-(4,5-dimetü-2-tiazolil)-2,5-difenü-2H-tetrazólium-bromid, INT * 2-(p-jód-fenil)-3-(p-nitro-fenil)-5-feni]-2H-tetrazófyum-kjorid, ) BT = 3,3 -{3,3 -dimetoxi-4,4 -bifenüén)-bisz(2,5-difen3-2H-tetrazólium-klorid), TV = 3-{a-naftil)-2,5-difenil-2H-tetrazóliuni-klorid, TT = 2,3,5-trjfenil;2H-tetrazólium-klorid, NT = 3,3 -(4,4 -bifenilén)-bisz(2,5-difenü-2H-tetrazóliuip-klorid), , ABTS = 2,2 -azino-bisz(3,3 -et0-benztiazolin-6,6’-szulfonsav). A felsorolt tetrazóliumsók segítségével a diagnosztikai készlet színátcsapása a kimutatni kívánt dehidrogenázok kóros küszöbértékére különösen jól beállítható. Ezért a tetrazóliumsók - különösen az NBT — redox-színezékként való használata előnyös. A hordozón lévő anyagkeverék pH-értéke 5,0-nál kisebb, előnyösen 3,0 és 5,0 között van, a 4,5 pH érték különösen előnyös. Meglepő, hogy az a reakció, amelyet a készlet alkalmazása során például az LDH katalizál, ilyen alacsony pH-tartományban lejátszódik, mivel — amint ez a b) reakcióvázlatból látható — a laktátnak piruváttá való átalakulása során hidrogénionok szabadulnak fel. így az lett volna várható, hogy a hidrogénion-koncentráció további növekvésének következtében a 6,0 pH-értéken túl - amint ez a 2 443 741 számú Német Szövetségi Köztársaságbeli szabadalmi leírásból ismert a b) reakcióvázlat szerinti reakció még lassabban vagy egyáltalán nem megy végbe, illetve a reakció egyensúlyi állapota baloldali irányban eltolódik. Ezzel az elvárással ellentétben a reakció észrevehető lassulás nélkül a kívánt módon megy végbe, sőt - amint említettük - a találmány szerinti készlet diagnosztikai biztonsága az ismert eljárásokkal szemben tökéletesebb. Az anyagkeverék kívánt pH-értéket a szokásos módon, például sósav és/vagy foszforsav hozzáadásával állíthatjuk be. A diagnosztikai készlet egyik előnyös kiviteli alakja szerint az anyagkeverék a pH-érték beállítása és/ vagy megtartása céljából egy pufferrendszert tartalmaz. Ennek segítségével a diagnosztikai készlet alkalmazása során a reakcióközeg pH-értéke kedvező tartományban tartható - még akkor is, ha a vizsgálandó folyadéknak a pH-értéke ettől eltér. A pufferrendszer előnyösen trietanol-amin hidroklorid vagy trietanol-amin és hidrogén-klorid nem ekvivalens keveréke. A hidrogén-kloridot például sósav formájában adhatjuk a rendszerhez. Alkalmazhatók azonban más pufferrendszerek is — például foszfátpufferek - ha nem kívánt mellékreakciókat nem idéznek elő. A megfelelő pufferrendszerek a szakember számára jól ismertek. A diagnosztikai készlet egy előnyös továbbfejlesztése szerint az anyagkeveréx egy olyan vegyületet is tartalmaz, amely hidrogén- vagy elektronátvivőként működik. Ez a vegyület például egy tetrazóliumsónak a megfelelő színes formazánná való redukcióját katalizálja. Erre a célra a hidrogén- vagy elektronátvívő redoxpotenciálja értékének a találmány szerint alkalmazott redoxrendszer (például a NAD/NADH-rendszer) és a redox-színezék (például tetrazóliumsók) redoxpotenciálja között kell lennie. Az ilyen működő vegyületekre jellemző példa a fenazin-metoszulfát (PMS), diaforázok, Meldolakék és a manedion. További, megfelelő vegyülétek a szakember számára jól ismertek. A b), c) és d) reakcióvázlatok megvilágítják a diagnosztikai készlet alkalmazása során lejátszódó reakciókat abban az esetben, ha a NAD/NADH redoxrendszert, elektronátvivőként PMS-t és tetrazóliumsóként NBT-t alkalmazunk. Olyan diagnosztikai készletek esetében, amelyek célja a női nemiszervek karcinómáinak megállapítása, hordozóként a cellulózrostokból álló tamponok különösen jól beváltak. Alkalmazásuk során a tamponokat bevezetjük a hüvelybe, s igy lehetségessé válik a tamponra felvitt anyagkeveréknek a hüvelyváladékkal végbemenő reakciója. A vizsgálat azonban a testen kívül is végrehajtható úgy, hogy például a kivett hüvelyváladékot a testen kívül az impregnált tamponnal érintkezésbe hozzuk. Más hordozóformák - például pálcikák vagy fóliák — is használhatók. A hordozó anyaga természetes és/vagy szintetikus lehet: például rostos, szemcsés vagy egyéb szerkezetű. A hordozó minden esetben poláris csoportokat tartalmaz. Ha a diagnosztikai készlet hordozó anyaga például egy tampon, akkor a készlet nemcsak testen belüli, hanem testen kívüli diagnosztizálásra is alkalmas. Az utóbbi esetben a vizsgálandó folyadékot, illetve vizsgálandó testváladékot a fentebb említett anyagkeveréket tartalmazó tamponnal egyszerűen érintkezésbe hozzuk. A találmány a diagnosztikai készletnek kóros elváltozások, különösen emberek, állatok és növények rosszindulatú megbetegedéseinek korai felismerése céljából való alkalmazására Is vonatkozik. A diagnosztikai készletnek egyik előnyös alkalmazása dehidrogenázoknak emberi, állati vagy növényi, sejten kívüli folyadékokban jelenlévő, kórosan megnövekedett koncentrációjának testen belüli vagy kívüli kimutatása, aminek során a hordozón lévő anyagkeveréket a vizsgálandó folyadékkal reakcióba hozzuk olyan körülmények között, hogy az anyagkeveréknek a vizsgálandó folyadékkal való reakciója legfeljebb 10 perc alatt végbe menjen. A legjobb eredményeket akkor kapjuk, ha ez az időtartam 5—7 perc. Ez különösen abban az esetben érvényes, ha a diagnosztikai készlet hordozója egy tampon, amelyet diagnózis céljából egy vizsgálandó nő hüvelyébe vezetünk. Ebben az esetben a tamponnak a hüvelyben való tartozókodási ideje felel meg a fentebb említett időtartamnak. Ha ez a tartózkodási idő 10 percnél több, akkor egyes esetekben a tamponon akkor is felléphet színreakció, ha a vizsgált nő szervezetében kóros elváltozás nincsen. Lényeges tehát, hogy a tampon tartózkodási ideje túlságosan hosszú ne legyen. A tampon találmány szerinti, optimális 5-7 perces tartózkodási ideje lényegesen rövidebb, mint a 2 443 741 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban közölt 15-30 perces tartózkodási idő. Ez a gyakorlati kivitelezés szempontjából 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
