189515. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 20-dihidro-20,23-didexi-tionolid (tilakton) és észterei előállítására
1 189 515 2 A találmány tárgya eljárás, az egyszerűség kedvéért tilaktonnak elnevezett, új 20-dihidro-20,23- dideoxi-tilonolid makrolid és 3,5-di-0-( 1-4 szénatomosj-alkanoil-származékainak előállítására. A tilakton szerkezetét az (I) képleten mutatjuk be. A fenti vegyületet előnyösen használhatjuk fel a (II) általános képletű acil-származékok előállításakor, ahol az általános képletben R és R, a fenti acilcsoport. Az (I) és (II) általános képletű vegyületeket előnyösen használhatjuk 16-tagú makrolid antibiotikumok előállításakor köztes vegyületként. Bár az előzőekben megadott képletekben a sztereokémiái viszonyokat nem jeleztük, a vegyületek sztereokémiája azonos a tilozinéval. Á tilaktont a 3- és az 5-hidroxil-csoportokon ismert módszerekkel, aeilezöszerekkel reagáltatva, acil-észter-s/ármazékokká alakíthatjuk át. A tilakton aeil-és/ter-származékait előnyösen használhatjuk új makrolid antibiotikumok előállításakor. Acilezöszerként például anhidrideket, halogenideket (általában bázissal, vagy más, savelnyelő vegyülettel együtt) szerves savak aktív észtereit használjuk. Az aeilezést elvégezhetjük egy szerves sav és egy dehidratálószer. például N,N'-diciklohexilkarbodiimid elegyével is. Az aeilezést végezhetjük enzimatikusan is. például az Okamoto és munkatársai által a 4 092 473 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint eljárva. A képződött acil-származékokat ismert módszerekkel különíthetjük el és tisztíthatjuk. A származékokat az irodalomból ismert észterezési módszerekkel állíthatjuk elő, mint például az átalakítandó vegyület sztöchiometrikus mennyiségű (vagy enyhén fölös mennyiségben jelenlévő) acilezöszerrel, mint például acil-anhidriddel reagáltatva. szerves oldószerrel (például piridinnel) készült reakcióelegyben 0 °C és szobahőmérséklet között, 1-24 órán át, mialatt az észterezési reakció gyakorlatilag teljesen lezajlik. Az észter-származékot a reakcióelegyben ismert módszerekkel, például extrakcióval, kromatográfiával és kristályosítással izoláljuk. A tilakton előállítására a Streptomyces fradiae NRRL 12 188 törzset vagy valamely mutánsát süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, megfeelő táptalajban addig tenyésztjük, mig jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fél. A Streptomyces fradiae tenyésztésére használható táptalajok többfélék lehetnek. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék könnyű izolálása érdekében azonban egyes táptalajokat előnyben részesítünk. így például szénforrásként a nagyméretű fermentációkkor, például szénhidrátokat, mint például dextrint, glükózt, keményítőt. kukoricalisztet és olajokat, mint például szójabab olajat használunk. Nitrogénforrásként előnyösen kukoricalisztet, szójabab lisztet, hallisztet. aminosavakat és más anyagokat használunk. A táptalajba a fentieken kívül szervetlen sókat is adunk; ilyenek a közönséges oldható sók, amelyek vas-, kálium-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát- vagy nitrát-ionokra. vagy más hasonló ionokra disszociálnak. "> A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez esszenciális nyomelemeket is tartalmaznia kell a táptalajnak. Ezek a nyomelemek általában szenynyezőanyagként jelen vannak a táptalaj többi alkotórészében, mégpedig olyan koncentrációban, amely kielégíti a mikroorganizmus növekedési igényeit. A nagyméretű fermentáció során habzás esetén kevés (például 0,2 ml/1) habzásgátlót, mint például polipropilén-glükolt (molekulasúlya 2000) adagolunk. Jelentős mennyiségű tilakton előállításához süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk tankfermentorban. Kevés tilakton előállítható rázott tenyészetben is. Ha a nagyméretű fermentációk során a mikroorganizmus spóráival oltunk, úgy a termelésben lag-fázis mutatkozik; így előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumaival. ily módon friss, aktívan növekvő tenyészethez jutunk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a főfermentációs táptalajt. A vegetatív inokulum készítéséhez használt táptalaj azonos lehet a főfermentációs táptalajjal, használhatunk azonban mást is. A találmány szerinti eljárás értelmében a termelést a tilozint termelő Streptomyces fradiae törzs kémiai mutagenezisével nyert új mikroorganizmust tenyésztjük. Az új mikroorganizmus csak minimális mennyiségű tilozint bioszintetizált, major komponensként a tilaktont termeli. A találmány során a tilaktont termelő új mikroorganizmust használjuk. Az új mikroorganizmust szintén Streptomyces fradiae-nek határoztuk meg. A mikroorganizmus egy tenyészetét letétbe helyeztük a Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61 604, törzsgyűjteményébe, ahol a tenyészet NRRL 12 188 számon megrendelhető. Ahogy az más mikroorganizmusoknál is megtörténik, a Streptomyces fradiae NRRL 12 188 tulajdonságai variálnak. így például különböző fizikai és kémiai mutagénekkel kezelve a sejteket, például ultraibolya fénnyel, X-sugarakkal, gamma-sugarakkal vagy N-metil-N'-nitro-N-nitrozó-guanidinnel előállíthatok az NRRL 12 188 törzs rekombinánsai, mutánsai vagy variánsai. A Streptomyces fradiae NRRL 12 188 összes olyan természetes és mesterséges variánsa és mutánsa alkalmazása, amely rendelkezik a tilakton-termelés képességével, a találmány oltalmi köréhez tartozik. Az S. fradiae NRRL 12 188 10 °C és 40 'C hőmérsékleten növekszik. A tilakton-termelés szempontjából az optimális hőmérséklet 28 °C. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációs folyamatoknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A tankfermentáció esetén az antibiotikum-termelés szempontjából optimális, ha a levegő-telítettséget 30%-on, vagy e felett tartjuk (28 °C hőmérsékleten és 1 atm nyomáson). A tilakton termelését a fermentáció során a tenyészetből vett minták vizsgálatával követjük; a vizsgálatot nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával egybekötött ultraibolya-detektálással végez-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
