189504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lutenizáló hormon felszabaduást gátló dekapeptid származékok előállítására
1 189 504 2 védőcsoportok az Arg oldalláncbeli nitrogénatomjain. X5 jelentése Gly-0-CH2-[gyanta], 0-CH2-[gyarita] vagy Gly-NH-[gyanta]. Az X2 - X4 oldallánc-védőcsoportok kiválasztásának kritériuma, hogy a védőcsoport stabil legyen a reagenssel szemben annak a reakciónak a körülményei között, melyet a szintézis minden lépésénél az a-aminocsoport eltávolítására alkalmazunk. A védőcsoportnak nem szabad lehasadnia a kapcsolás körülményei között, és eltávolíthatónak kell lennie a kívánt aminosav-szekvencia szintézisének befejezése után, a peptidláncot nem befolyásoló reakciókörülmények között. Ha X5 jelentése Gly-0-CH2-[gyanta], a polisztirol gyantahordozó számos funkciós csoportja egyikének észterrésze vesz részt a kötés kialakításában. Ha az X5 csoport Gly-NH-[gyanta], úgy amidkötés kapcsolja a Gly-t a BHA gyantához vagy az MBHA gyantához. Ha X acetil-, formil-, akrilil-, vinil-acetil-, benzoilcsoportot vagy valamely legfeljebb 7 szénatomos más acilcsoportot jelent, akkor X úgy használható, mint az X1 védőcsoport az aminosav a-aminocsoportjához, és ebben az esetben az utolsó aminosavnak a peptidlánchoz való kapcsolása előtt alkalmazhatjuk. Azonban úgy is eljárhatunk, hogy a reakciót a gyantán levő pepiiddel hajtjuk végre, például ecetsavval reagáltatjuk diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében, vagy előnyösen ecetsavanhidriddel. A teljesen megvédett peptid a klórmetilezett gyantáról ismert módon ammonolizissel hasítható le és így teljesen megvédett amid közbenső terméket kapunk. A peptid védőcsoportjainak eltávolítását, valamint a peptid Iehasítását benzhidril-amin gyantáról 0 °C-on hidrogén-fluorid (HF) segítségével hajtjuk végre. A HF-os kezelés előtt anizolt adunk a pepiidhez. A HF vákuumban való eltávolítása után a lehasított, védőcsoportmentesített pepiidet éterrel kezeljük, dekantáljuk, híg ecetsavban felvesszük és liofilizáljuk. A peptid tisztítása ioncserélő kromatográfiával történik karboxi-metil-cellulóz (CMC) oszlopon, majd megoszlásos kromatográfiát végzünk Sephadex G-25 oszlopon n-butanol-0,l n ecetsav (1:1 térfogatarány) eluenst használva, vagy ismert módon nagynyomású folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmazunk. A találmány szerinti peptidek 200 pg per testsúly-kg-nál alacsonyabb dózisszinteken hatásosan gátolják nőstény patkányok ovulációját, ha déltájban a proösztrusz napján alkalmazzuk őket. Az ovuláció tartós visszaszorítása céljából körülbelül 0,1-5 mg per testsúly-kg dózisszintek alkalmazása szükséges. A találmány szerinti antagonisták hatásos fogamzásgátlók is, ha szabályos ütemben hím emlősöknél alkalmazzuk őket. Mivel e vegyületek csökkentik a tesztoszteronszintet (nemkívánatos következmény normális, szexuálisan aktív hímeknél), célszerű lehet tesztoszteron utánpótlási dózisokat alkalmazni az LRF- antagonistával együtt. A következő példák a találmány további jellegzetességeit ismertetik, anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátoznák. A fentebb említett szilárd fázisú technikával az alábbi általános képletű peptideket állítjuk elő : X-dehidro-Pro-R2-D-T rp-Ser-T yr-D-T rp-Rs-Arg- Pro-Gly-NH2 I. Táblázat 1. példa (50%-os ecetsav, c — 1) Peptid X r2 Rs a22 UD 1. Ac 3,4-diklór-D-Phe Leu-79,9 ° 2. Ac 4-trifluor-metil-D-Phe Leu-69,1 ° 3. Ac 4-fluor-D-Phe Leu-78,2 0 4. Ac 4-acetiI-amino-D-Phe Leu-76,5 0 5. Ac 4-nitro-D-Phe Leu-29,6 ° 6. Ac 4-bróm-D-Phe Leu-76,0 ’ 7. Ac 4-metiltio-D-Phe Leu-79,8 ° 8. Ac 4-metoxi-D-Phe Leu-82,7 ° 9. Ac 4-metil-D-Phe Leu-81,7° 10. Ac 2,4-diklór-D-Phe Leu-77,2 ° 11. Acr 3,4-diklór-D-Phe Leu-72,5 ° 12. Ac 4-metoxi-D-Phe NaMeLeu-113,4° 13. Ac 4-metil-D-Phe NaMeLeu-106,5° 14. Ac 3,4-diklór-D-Phe N°MeLeu-110° Példa gyanánt a fenti 1. számú peptid - melyet [Ac-dehidro-Pro1, 3,4-diklór-D-Phe2, D-Trp16]LRF-nek neveznek - jellemző szilárd fázisú szintézisét az alábbiakban ismertetjük. A peptid képlete a következő : Ac-dehidro-Pro-3,4-diklór-D-Phe-D-T rp-Ser-T y r- D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. BHA gyantát használunk, és Boc-védett Gly-t kapcsolunk a gyantához metilén-dikloridban (CH2C12) 2 óra alatt; a Boc-származékot háromszoros feleslegben alkalmazzuk és aktivátorként diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használunk. A glicin-rész a BHA-részhez amidkötéssel kapcsolódik. Minden aminosav hozzákapcsolása után a mosást, védőcsoportlehasítást és a következő aminosav hozzákapcsolását az alábbi munkamenet szerint hajtjuk végre automatizált készülék segítségével és körülbelül 5 g gyantából kiindulva : Keve-Lépés Reagensek és műveletek rési idők (perc) 1. CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 'J Metanol (MeOH) mosás - 30 ml \ z. (kétszer) J 3. CH2C12 mosás - 80 ml (háromszor) 3 4. 50% trietanol-amin (TEA)+ 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben - 70 ml (két-10 szer) 5. CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 6. 12,5% TEA CH2CI2-ben - 70 ml (kétszer) J 7. MeOH mosás - 40 ml (kétszer) 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
