189504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lutenizáló hormon felszabaduást gátló dekapeptid származékok előállítására
1 189 504 2 Lépés Reagensek és műveletek Keverési idők (perc) 8. CH2C12 mosás - 80 ml (háromszor) 3 9. Boc-aminosav (10 millimol) 30 ml dimetil-formamidban (DMF) vagy CH2Cl2-ben, függően az illető védett 30-300 aminosav oldhatóságától (egyszer) plusz DCC (10 millimol) CH2Cl2-ben 10. MeOH mosás - 40 ml (kétszer) 3 11. 12,5% TEA CH2Cl2-ben - 70 ml O (egyszer) J 12. MeOH mosás - 30 ml (kétszer) 3 13. CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 A 13. lépés után alikvotot veszünk ki ninhidrinpróbához: ha a próba negatív, visszatérünk az 1. lépéshez a következő aminosav kapcsolása céljából; ha a próba pozitív vagy enyhén pozitív, megismételjük a 9-13. lépést. A találmány szerinti peptid minden egyes aminosavának kapcsolásához a fenti munkamenetet alkalmazzuk, miután az első aminosavat a hordozóhoz kapcsoltuk. N“Boc-védelmet alkalmazunk a fennmaradó összes aminosavhoz a szintézis folyamán. Az Arg oldalláncot Tos csoporttal védjük meg. Oldalláncvédő csoportként OBzl csoportot használunk a Ser hidroxilcsoportjához, és 2,6 diklór-benzil-csoportot alkalmazunk oldalláncvédő csoportként a Tyr hidroxilcsoportjához. Végső aminosavként N-acetil-dehidro-Pro-t építünk be. A CH2CI2-ben rosszul oldodó Boc-Arg(Tos) és Boc-D-Trp kapcsolását DMF-CH2C12 keverékben hajtjuk végre. A peptid lehasítása a gyantáról és az oldalláncok teljes védőcsoportmentesítése igen könnyen végbemegy 0 °C-on HF hatására. Szennyezések eltávolítására szolgáló anyagként anizolt alkalmazunk a HF-kezelés előtt. Miután a HF-ot vákuumban eltávolítottuk, a gyantát 50%-os ecetsavval extraháljuk és a mosófolyadékokat liofilizálva nyers peptidport kapunk. A pepiidet ezután ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk CMC-oszlopon (Whatman CM 32) és az oszlopot 50 : 50 arányú metanol-víz eleggyel készült 0,05-0,3 molos ammónium-acetát gradienssel eluáljuk, majd megoszlásos kromatográfiát végzünk gélszerű oszlopon, n-butanol-0,1 n ecetsav (1:1 térfogatarány) eluens rendszert használva. A fenti táblázatban ismertetett peptideket in vitro és in vivo vizsgáljuk. Az in vitro próbához diszszociált patkány-hipofizissejteket használunk, melyeket a próba előtt 4 napig sejttenyészetben tartunk fenn. A peptidek alkalmazására válaszképpen kialakult LH-szinteket a patkány-LH-ra specifikus radioimmunpróbával határozzuk meg. A sejtkulturákat tartalmazó kontroll csészékhez csak 3 nanomol LRF-et adunk, míg a kísérleti csészékhez 3 nanomol LRF-et plusz 0,01-3 nanomol vizsgálandó pepiidet. A csak LRF-fel kezelt mintákban szekretált LH mennyiségét összehasonlítjuk a pepiiddel plusz LFR-fel kezelt mintákban szekretált LH mennyiséggel. Az eredmények az IA. táblázat In Vitro oszlopában láthatók, ahol az vizsgált peptid és az LRF molkoncentrációjának azon arányát adjuk meg, (antagonista per LRF), amely 3 nanomol LRF-fel felszabadított LH mennyiségének a kontroll érték 50%-ára való csökkentéséhez szükséges (ICRS0). In vivo próbában meghatározzuk a fenti peptidek nőstény patkányok ovulációját gátló hatásosságát. E próbában meghatározott számú, 225-250 g súlyú érett nőstény Sprague-Dawley patkányt beoltunk kukoricaolajban felvett 5 vagy 10 pg pepiiddel, déltájban a proösztrusz napján. A proösztrusz az ösztrusz (ovuláció) előtti délutánra esik. Kontrollként külön nőstény patkánycsoportot használunk, melynek nem adunk be peptidet. A kontroll nőstény patkányok mindegyikénél ovuláció következik be az ösztrusz (ivarzás) idején. Amint az IA. táblázat In Vivo oszlopában látható, a peptidek nagyon hatásosan gátolják a nőstény patkányok ovulációját igen alacsony dózisokban, és valamennyi peptidkészítményt tökéletesen hatásosnak tartunk 1 mg dózis alkalmazásakor. IA. táblázat Peptid In Vitro icr50 ln Vivo (10 pg) Ovuláló patkányok ln Vivo (5 Pg) Ovuláló patkányok 1. 0,039 0,10 4/7 0,070 7 9 3. 0,021 0 10 0 10 4. 9/10 5. 0,011 0 10 2 10 6. 0,010 5/7 f. 0,030 1 10 7,10 S. 0,125 3/10 9. 0,044 17 9,9 10. 5 10 4 7 11. 0,048 1,10 4 10 12. 0,29 5,10 13. 0,11 3/4 14. 0,05 1,3 2. példa A következő, XR,-p-klór-D-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-R4-R5-Arg-Pro-R6 általános képletü peptideket állítjuk elő az 1. példában általánosan leírt szilárd fázisú eljárással, a 20. számú peptid kivételével, melyet klórmetilezett gyantán állítunk elő. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
