189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
1 189 469 2 a molekulában legalább két, szulfidkötést (—S— kötést) létrehozni képes funkcionális csoportot tartalmazó térhálósítószer é$ egy tiolcsoport (—SH) reakciójából származtatható le. Ilyen térhálósítószerek például - mint legelőnyösebbek - a III általános képletű dimaleinimid-vegyületek és a IV általános képletű bisz(halogén-karbonil)-vegyületek. A III általános képletben Y kétvegyértékü szerves csoportot jelent. A IV általános képletben Z kétvegyértékü szerves csoportot jelent, és X2, melyek azonosak vagy eltérők lehetnek, bróm- vagy. jódatomot jelentenek. A III általános képletű dimaleinimid-vegyületekre példaként megemlitjük a következő vegyületeket : N,N’-(l,2-fenilén)-dimaleinimid, N,N’-(l,4-fenilén)-dimaleinimid, 4,4-bisz(maleoil-amino)-azobenzol és (N-maleinimido-metil)-éter. A IV általános képletű bisz(halogén-karbonil)-vegyületekre példaként megemlítjük a következő vegyületeket: N,N’-alkilén-bisz(bróm-acetamid) és N,N’alkilén-bisz(jód-acetamid) (ahol az alkiléncsoport 2-15 szénatomot tartalmaz). A találmány szerinti daganatellenes immunoglobulin-származékok előállítása az alábbiakban ismertetett módokon történhet. (1) Legalább egy S-szulfo-csoportot vagy V általános képletű aktív diszulfidcsoportot tartalmazó Fab fragmens reagáltatása legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegységgel. Ebben az eljárásban a Fab fragmens egy mólnyi mennyiségére számítva előnyösen 0,3-3 mól A alegységet használunk fel. A reakció lefolytatható úgy, hogy a Fab fragmenst és az A alegységet egy 5-10 pH-jú pufferben keverjük, amelyben a teljes fehérjekoncentráció 0,5-100 mg/ml (előnyösebben 1-20 mg/ml), majd a keveréket 0-60 °C-on állni hagyjuk, majd a reakcióelegyet vele azonos pH-jú puffer ellenében dializáljuk. A reakcióidő általában 30 perc és 3 nap között van a reakciókörülményektől függően. Az A alegységből és Fab fragmensből álló hibrid elkülönítése a reakcióelegyből és tisztítása a szokásos módszerek szerint történhet, például dialízissel vagy molekulaszűrő hatású oszlopkromatográfiás eljárással. A fenti módszer lehetővé teszi a reakció mérsékelt körülmények közötti síma lefolytatását, valamint nagy tisztasági fokú hibrid kinyerését. Az eljárás még azzal az előnnyel is jár, hogy biztosítja a Fab fragmensből és A alegységből álló hibrid szelektív képződését (összehasonlítva olyan hibrid képződésével, amelyben két Fab fragmens között vagy két A alegység között jön létre kapcsolódás a diszulfid kötés révén). (2) Legalább egy tiolcsoportot tartalmazó Fab fragmens és legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegység összekapcsolása a fent említett III vagy IV általános képlettel jellemezhető térhálósítószerek felhasználásával. Ebben az eljárásban a reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a három komponenst, azaz a Fab fragmenst, a térhálósítószert és az A alegységet egyszerre hozzuk érintkezésbe; azonban előnyös, ha a hibrid előállítását úgy végezzük el, hogy először a Fab fragmenst reagáltatjuk a térhálósítószerrel és az így kapott terméket reagáltatjuk az A alegységgel, vagy először az A alegysége1, reagáltatjuk a térhálósítószerrel, és az így kapott reakcióterméket reagáltatjuk a Fab fragmenssel. Az első esetben egy mólnyi Fab fragmensre számítva előnyösen 0,8-6 mól térhálósítószert, illetve A alegységet használunk. A második esetben az A alegység egy móljára számítva előnyösen 0,8-3 mól térhálósítószert, illetve 0,2-3 mól Fab fragmenst használunk. A reakciót 0-60 “C-on indítjuk el keverés közben és kis menynyiségü oldószerben (például N,N-dimetil-formumidban, dimetil-szulfoxidban, 1,2-dimetoxi-etánban, metanolban, etanolban, acetonban stb.) feloldott térhálósítószer hozzáadásával. Az adagolást a Fab fragmens vagy az A alegység 6-10 pH-értékre pufferolt oldatához végezzük el (a fehérjekoncentráció előnyösen 0,5 és 100 mg/ml közé, vagy előnyösebben 1 és 20 mg/ml közé esik). A reagálatlan térhálósítószer eltávolítása után - melyet dialízissel vagy molekulaszűrő hatású oszlopkrotnatográtíás eljárással végzünk el - a reakció végrehajtása céljából 0-60 °C-on hozzáadjuk a másik komponenst (A alegység vagy Fab fragmens) 6-10 pH-értékre pufferolt oldat formájában (a fehérjetartalom előnyös tartományai megegyeznek az imént megadottakkal). A Fab fragmens és az A alegység által képzett hibrid elkülönítését a reakcióelegyből, valamint a hibrid tisztítását a szokásosan alkalmazott eljárásokkal végezhetjük el, például molekulaszűrő hatású oszlopkromatográfiás eljárással. (3) A daganatellenes immunoglobulin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó Fab fragmensének és ricin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegységének diszulfid híddal való összekötése oxidativ reakcióval. Ami az oxidativ reakciót illeti - amelyek során a két komponens egymással bensőséges érintkezésben áll -, bármilyen levegőn végrehajtható oxidációs eljárás, o-jód-benzoesavas oxidációs eljárás, valamint o-fenantrolin/réz-szulfát rendszerben végrehajtott oxidációs eljárás alkalmazható. A találmány értelmében különösen előnyösek az (1) és (2) pont alatt ismertetett eljárások. A találmány szerinti eljárással előállított daganatellenes fehérjeszármazék tartalmaz egyrészt egy A alapegységből álló és ráksejtekkel szemben toxikus oldalíáncot, másrészt egy Fab fragmenst tartalmazó oldalláncot, amely szelektíven felismeri a ráksejtet, és mint hordozó működik az említett A alegységnek a ráksejthez irányitásában, valamint bejuttatja az A alegységet a sejtbe. Ez a hibrid az alábbiakban felsorolandó kiváló tulajdonságokkal rendelkezik. (1) Minthogy a találmány szerinti eljárással előállított származék nem tartalmazza az immunoglobulin Fc részét, nem következik be az Fç résznek a sejtmembránon elhelyezkedő Fc-receptorokon való nem-specifikus megkötödése, és ez a tény lehetővé teszi, hogy a Fab fragmens az ellenanyag-hatását az ellenanyaghoz szelektíven kapcsolódva fejtse ki. (2) Ismeretes, hogy xenogén immunoglobulin használatakor az Fc rész rendelkezik a legerősebb antigenicítással. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek esetében - minthogy az nem 5 10 15 20 25 30 '35 40 45 50 55 60 65 5
