189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
1 . 189 469 2 tartalmazza az immunoglobulin Fc részét - a xenogén immunoglobulin antigenicitása jelentős mértékben csökken. (3) Ismeretes, hogy a ricin molekula esetében a B alegységre az jellemző, hogy a sejtek receptorához hozzákapcsolódik (egészséges sejtek és ráksejtek), valamint az, hogy az A alegység úgy juthat be a sejtbe, hogy a B alegység hozzákapcsolódik a sejtmembránhoz a citotoxikus hatás kifejtése végett. Mivel a találmány szerinti hibrid nem tartalmaz B alegységet, egészséges sejtek viszonylatában csak ritkán van citotoxikus hatással. Ezen túlmenően, minthogy a találmány szerinti hibrid nem tartalmaz B alegységet, a ricin antigenicitása is csökken. (4) A találmány szerinti eljárással előállított származék tartalmaz egy oldalláncot, amely lényegében a daganatellenes immunoglobulinból nyert Fab fragmensből áll, és ez az oldallánc specifikusan felismeri a ráksejtet, s arra kényszeríti a ráksejtet, hogy beengedje a ricin A alegységét tartalmazó oldalláncot. így a bevezetett A alegység figyelemre méltó citotoxicitást mutat a ráksejttel szemben. A találmány részleteit az alábbi példákkal mutatjuk be. /. példa (a) Daganatellenes immunoglobulin Fab’ fragmensének előállítása DBA/2 Cr egerekbe átültettünk L 1210 leukémiás sejteket, melyeket egy DBA/2 Cr egér hasvizéből nyertünk ki. Körülbelül 10Ä leukémiás sejtből és Freund-féle teljes hatáserősítö adalékanyagból előállítottunk egy emulziót és intravénásán befecskendeztük nyulaknak. Ezután egy hét leforgása alatt három ízben fecskendeztük be szubkután úton a 106 L 1210 sejtet az adalékanyaggal együtt, és a nyulakból az utolsó injektálást követő hetedik és tizedik napon vérmintát vettünk. Az így kapott vérmintákat összekevertük, a szérumot elkülönítettük az összekevert vértől és 30 percig inaktiváltuk 56 “C-on. 200 ml így kapott antí-L 1210 antiszérumhoz 4 °C-on hozzáadtunk 200 ml telített vizes ammónium-szulfát oldatot, és a csapadékot (anti-L 1210 immunoglobulin) centrifugálással különítettük el. Az így kapott csapadékot feloldottuk 50 ml 0,01 mólos foszfátpufferben (pH = 7,6), ugyanazon puffer ellenében dialízissel tisztítottuk, így egy anti- L 1210 immunoglobulin oldatot kaptunk. Az oldatot ugyanazzal a foszfátpufferrel kezelt DEAE cellulóz oszlopon kromatografáltuk (oszlopméret: 3 x 94 cm), így nem adszorbeált frakcióként egy IgG-t tartalmazó oldatot kaptunk. Ezt az anti-L 1210 IgG-t (1,2 g) feloldottuk 40 ml 0,1 mólos acetát-pufferben (pH = 4,5), és az oldathoz hozzáadtunk 24 mg pepszint. A pepszínes bontást 18 órán át folytattuk 37 °C-on. A bontási terméket sóoldaton végzett Sephadex G200-as oszlopkromatográfiás eljárásnak vetettük alá (oszlopméret: 3,5 x 140 cm), így az eluálással körülbelül 100 000- es molekulasúlyú fehérjét vettünk ki. Nátriumdodecil-szulfát/poli(akril-amid) géllel végzett elektroforézissel (továbbiakban SDS PAGE-vel jelöljük) megerősítettük, hogy ez tiszta F(ab’)2 fragmens (lásd 3. ábra, 1 lemez). Az SDS’ PAGE eljárást a Weber és Mr. Osborn által javasolt eljárással [Journal of Biological Chemistry, 244, 4406-4412 /1969/] hajtottuk végre. Azonban jelen esetben az elektroforézist a 0,1% nátrium-dodecil-szulfát mellett 6 mól karbamidot tartalmazó oldatban hajtottuk végre, miközben a gél koncentrációját 6%-on tartottuk. 0,02 ml 150 mmólos 2-merkapto-etanolt hozzáadtunk 2 ml [0,01 mólos triszHCl - 0,14 mólos nátrium-klorid - 2 mólos etilén-diamintetraecetsav] oldathoz (pH = 8,3), amely 18,4 g F(ab’)2 fragmenst tartalmazott. A redukciót egy órán át folytattuk 37 °C-on, A redukciós terméket a 2-merkapto-etanol eltávolítása és az egy tiolcsoportot tartalmazó Fab’ fragmens kinyerése céljából [5 mmólos acetát-puffer - 0,14 mólos nátriumklorid - 1 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav] oldattal (pH = 5,5) kezelt Sephadex G25 oszlopon kromatografáltuk (1,0x20 cm) (lásd 3. ábra, 2 lemez). (b) 3-Karboxi-4-nitro-fenil-tio-csoportot tartalmazó Fab’ fragmens előállítása Miután a F(ab’)2 fragmenst a fent ismertetett módon redukáltuk, az így kapott fehérje oldathoz hozzáadtunk egy 0,2 ml 50 mmólos 5,5’-ditio-bisz(2-nitro-benzoecetsavat) tartalmazó etanolos oldatot abból a célból, hogy a reakciót szobahőmérsékleten 50 perc alatt lefolytassuk. A kis molekulasúlyú anyagok eltávolítása és a 3- karboxi-4-nitro-fenil-tio-csoportot tartalmazó Fab’ kinyerése végett a reakcióelegyet az (a) pontban ismertetett Sephadex oszlopon kromatografáltuk. (c) Ricin A alegységének előállítása S. Olsnes és A. Pihl által ismertetett eljárással (Biochemistry, 12, 3121-3126 old. /1973/) Ricinus Communis magvaiból ricint extraháltunk és tisztítottunk, majd elkülönítettük az A alegységet. Minthogy a kapott A alegység oldat 2-merkapto-etanolt tartalmazott, az oldatot közvetlenül felhasználása előtt az (a) pontban ismertetett Sephadex G25 oszlopkromatográfiás eljárásnak vetettük alá a 2-merkapto-etanol eltávolítása céljából. Az A alegység oldatának SDS' PAGE vizsgálatakor sem B alegységet, sem ép ricint nem találtunk (lásd 3. ábra, 3 lemez). (d) Daganatellenes fehérje-hibrid előállítása összekeverünk 1,8 ml [5 mmólos acetát-puffer -0,14 mólos nátrium-klorid - 1 mmólos etiléndiamin-tetraecetsav] oldatot (pH = 5,5) - amely 13,3 mg, aktív diszulfidcsoportot tartalmazó, (b) pontban előállított Fab’ fragmenst tartalmaz - 1,8 ml [5 mmólos acetát-puffer - 0,14 mólos nátriumklorid - 1 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav] oldattal (pH = 5,5) - amely 6,5 g, (c) pontban előállított A alapegységet tartalmaz -, valamint 0,3 ml [0,4 mólos foszfát-puffer - 0,01 mólos etiléndiamin-tetraecetsav] oldattal (pH = 7,23). A három komponens keverékét 4,5 órán át hagyjuk állni szobahőmérsékleten. 5 mg jód-acetamid hozzáadása után az elegyet 15 percig állni hagytuk szobahőmérsékleten, majd Sephadex G150 (szuperfinom) oszlopon (1,4x90 cm) kromatografáltuk. 2,1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk össze, és 280 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
