189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
1 2 189 469 daganatellenes ellenanyagot, majd azt a fentiek szerint dolgozzuk fel. Ismeretes, hogy az immunoglobulinoknak öt fő csoportja van - IgG, IgA, IgM, IgD és IgE -, és hogy alapszerkezetükben - mint ez az 1. (a) ábrán bemutatott típusminta rajzán is látható - két L-lel jelölt L lánc, valamint két H-val jelölt H lánc található, és ezeket a láncokat legalább három diszulfid híd (—S—S—) köti össze. Az 1. (a) ábrán látható immunoglobulin alapszerkezetével kapcsolatban elmondjuk, hogy az immunoglobulin egyrészt Fab részekből áll, amelyeket az ábrán Fab-bal jelölünk, másrészt Fcrészből, amelyet Fc-vel jelölünk; a Fab részek ellenanyag hatással rendelkeznek (amelyet a leírásban daganatellenes hatásnak nevezünk), vagy még pontosabban meghatározva olyan tulajdonsággal rendelkeznek, hogy szelektíven kapcsolódnak az antigénekhez; az Fc rész olyan természetű, hogy a sejtmembránon hozzákapcsolódik a komplementekhez vagy az Fc receptorokhoz. A Fab fragmenst - amely a találmány szerinti daganatellenes hatású fehérje-hibrid egyik oldallánca - tartalmazó oldallánc megfelel egy ellenanyag hatású fragmenst tartalmazó oldalláncnak (az ellenanyaghatás az immunoglobulin Fab részéből ered). Például ismeretes, hogy az IgGI - amely jellemző az emberi immunoglobulinokra - olyan szerkezettel rendelkezik, mint az 1. (b) ábrán bemutatott minta, és cisztin jelenlétében papainos bontásnak vetjük alá, ez az immunoglobulin az A-A’ szaggatott vonalak mentén két Fab fragmensre és egy Fc fragmensre hasad, mint ez az 1. (b) ábrán látható, és az így kapott Fab fragmensek felhasználhatók Fab fragmensként a találmány szerinti eljárásban. Ha az említett IgGl-et pepszinnel kezeljük, akkor az az 1. (b) ábrán látható B-B’ szaggatott vonal mentén hasad, így megkapjuk a Fab’ rész - amely a Fab részből és az ábrán ferdén bevonalkázott sarokrészből áll - F(ab')2 dimerjét. A két Fab fragmens úgy is kinyerhető, hogy a sarokrészben a diszulfid kötést reduktív úton hasítjuk - például egy tio-reagens használatával -, vagy a diszulfid kötést szulfitionokkal végzett szulfonálással hasítjuk. Minthogy ez a Fab’ fragmens a Fab fragmenshez hasonlóan ellenanyag hatással rendelkezik (jóllehet a komplementekhez nem kapcsolódik hozzá), a találmány szerinti eljárásban Fab fragmensként használható fel. A legalább egy merkaptocsoportot tartalmazó Fab fragmens átalakítható olyan Fab fragmenssé, amely egy helyettesített diszulfidcsoportot tartalmaz. A diszulfidcsoportot az V általános képlet mutatja be, ahol a Z jelentése 1, 2 vagy 3 képletű csoport. Ezt úgy végezhetjük el, hogy a Fab fragmenst 2,2’-ditio-piridinneI, 4,4’-ditio-piridinnel vagy 5,5’-ditio-bisz(2-nitro-benzoesavval) (Ellmanféle reagenssel) reagáltatjuk, és így az átalakított Fab fragmens a találmány szerinti Fab fragmensként használható fel. Az így előállított Fab fragmenst ilyen formában használjuk fel a találmány szerinti daganatellenes fehérje-hibrid előállitásához, legalábbis akkor, ha legalább egy tiolcsoportot (—SH), S-szulfo-csoportot (—S—S03~) vagy aktiv diszulfidcsoportot tartalmaz. Más esetekben csak akkor használjuk fel, ha már átalakítottuk olyan fragmenssé, amely legalább egy tiolcsoportot, S-szulfo-csoportot vagy aktív diszulfidcsoportot tartalmaz. Ez az átalakítás 5 ismert módszer szerint végezhető el a láncokban lévő diszulfid kötések legalább egyikének (a H láncokban vagy az L láncokban), és a láncok között elhelyezkedő diszulfid hidak (a H láncok és az L láncok között) legalább egyikének a hasításával. A Fab fragmensben lévő tiolcsoportok, S-szulfocsoportok vagy aktív diszulfidcsoportok száma előnyösen 1 és 5 között van (amely m = 1-5 értéknek felel meg az I általános képletben), de különösen előnyös, ha a láncok közötti kötések hasításával 15 kialakított tiolcsoportok, S-szulfo-csoportok vagy aktív diszulfidcsoportok száma 1 vagy 2 (megfelel az m = 1-2 értéknek az I általános képletben). A találmány szerinti eljárásban a ricinnek nevezett anyag egy fehérje toxin, amelyet ismert eljárás- 20 sál [például: S. Alsnes és A. Pihl, Biochemistry, 12, 3121-3126 /1973/J Ricinus Communis magvaiból nyerünk ki extrakcióval és tisztítással. A ricin két alegységből áll. Az A alegység egymáshoz diszulfid híddal kapcsolódik [2. (a) ábra]. Ha a ricint redukálószerrel így nátrium szulfittal kezeljük, akkor az A és B alegységekre bomlik. Mindkét alegység legalább egy merkaptocsoportot (—SH) tartalmaz, mint ez a 2. (b) ábrán is látható. A ricin részekre bomlása előtt állatokkal szemben igen erős toxici- 30 tással rendelkezik, azonban a B alegység önmagában csak gyenge toxicitással, az A alegység pedig még gyengébb toxicitással rendelkezik. Feltételezhető, hogy a ricin úgy fejti ki a fehérjék bioszintézisét inhibitáló citotoxicitását, hogy dezaktivál egy 35 olyan komponenst, amely nélkülözhetetlen a peptidláncok növekedésében. Az A alegység olyan hatással rendelkezik, hogy inhibitálja a fehérje bioszintézisét a sejten kívüli rendszeren, míg a B alegység nem rendelkezik ilyen hatással, viszont utóbbi- 40 nak megvan az a képessége, hogy képes kapcsolódni egy sejt receptorához, amely az A alegységnél nem tapasztalható. A találmány szerinti eljárásban az A alegységet használjuk. A találmány szerinti eljárásban az anti-L-1210 45 immunoglobulint - amely legalább egy tiolcsoportot, S-szulfo-csoportot vagy aktív diszulfidcsoportot tartalmaz - a későbbiekben ismertetésre kerülő reakciókörülmények között közvetlenül reagáltatjuk ricin A alegységével - amely legalább egy tiol- 50 csoportot tartalmaz -, így II’ általános képletű daganatellenes fehérje-hibrideket kapunk, amelyek megfelelnek azoknak az I általános képletű fehérjehibrideknek, amelyek képletében N értéke 0. A II’ általános képletben a Fab, RA, m, S, és S2 jelentése 55 megegyezik az I általános képletnél megadottakkal. Ezek közül könnyű előállíthatóságuk, elkülöníthetőségük és tisztíthatóságuk miatt különösen előnyösek a II általános képlettel jellemezhető fehérjehibridek. A II általános képletben Fab, RA, S, és 60 S2 jelentése megegyezik az I általános képletnél megadottakkal, míg p értéke 1 vagy 2. A találmány szerinti eljárásban a kétvegyértékű szerves csoport - amelyet X-szel jelölünk abban az esetben, ha az említett I általános képletben n érté- 0g ke 1 - egy olyan szerves csoportot jelent, amely egy, 4
