189441. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Streptomyces és a Nocaradia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymásközötti genetikai információ cseréjére, protoplasztok fúzióvjával
1 . 189 441. 2 2. táblázat Körülmények A szülő markere+ Első szülő Második szülő Kezelés polietilénglikollal Hígítóoldat Prototrof rekombinánsok, revertánsok /ml+ + Spektinomycin vagy rezisztens prototrofok 1 metA arg spc metB + P + PEG 2,4 x KP 6/7 2 metA arg spc metBP 6,6 x 103 8/8 3 metA arg spc metBH20 7,0 x 101 11/11 4 metA arg spc+ P+PEG <10» 0/0 5 metA arg spcP <10' 0/0 6 metA arg spcH20 <10* 0/0 7-metB + P + PEG 2x 101 0/3 8-metBP 2x 10' 0/6 9-metB-h2o 2 x 101 0/8 10 metA arg spc cysD + P 1,1 xlO5 Nm 11-cysD + P <101 Nm 12 metA arg spc+ P <10* Nm + A következő genetikai jelzéseket használtuk (Hopwood és munkatársai, Bact. Rév., 37, 371-405, 1973); a metA, az arg és a metB jelek auxotrof törzsekre utalnak. Az spc jelzés az 50 pg/ml spektin amicinre való rezisztenciát jelzi. + + R2 táptalajon határoztuk meg. Nm = Nincs meghatározva. Ahogy az 1. táblázatban megadott adatokból is kiderül, egy kismértékű, de szignifikánsan jelentkező rekombinációs értéket kaptunk oly módon, hogy centrifugáltuk a protoplasztokat, majd polie- 3n tilén-glikolt nem tartalmazó P táptalajban szuszpendáltuk őket, A protoplasztok fúziójának ez a mértéke a pufferban lévő kalcium-ionok jelenlétének tulajdonítható. Ha a protoplasztokat desztillált vízzel hígítottuk, úgy a rekombinánsok száma 3«, százszor kevesebb. Gyakorlatilag az Összes vizsgált genetikai rekombináns tartalmazza az spc genetikai markert, amely a metA arg genetikai markereket hordozó törzsből származik; ez kizárja annak lehetőségét, hogy a metB genetikai markert hordozó 43 törzs reverziója meghamisítja adatainkat. A kétszeresen jelzett auxotrof törzs egyetlen esetben sem revertál prototroffá, ami kizárja ennek a törzsnek a reverzióját, ahogy az az eredményekből is kiderül. A 2. táblázatban megadott adatok további bizonyítékát nyújtják annak, hogy rekombináció nem következik be a protoplasztok fúzióját követően. Újra klónozáskor kiderül, hogy az összes feltételezett rekombináns tulajdonságai állandóak. A kísérletekben használt Streptomyces fradiae törzs a i,q tilozin nevű antibiotikumot termeli. Ezen S. fradiae törzs több genetikai rekombinánsa tilozin-termelőnek bizonyult. 55 3. példa A genetikai keresztezést a Streptomyces griseofuscus törzzsel végeztük. A 2. példában megadott kísérletet ismételjük ^ meg, azzal a különbséggel, hogy a. a Tripticaseszójás táptalajt 0,8% glicinnel egészítjük ki; továbbá b. a rekombináns telepeket 34 °C hőmérsékleten 7 napon át kivitelezett inkubáció után számláljuk meg. A kísérletek eredményeit a 3. táblázatban adjuk meg. Mind a 6 kísérleti körülmény során polietilénglikollal kezeltük a protoplasztokat, amíután P oldattal hígítottuk őket, majd R2 táptalajra szélesztettünk. A genetikai rekombinánsok gyakorisága minden esetben 103- 1 Óvszer nagyobb volt, mint a háttérben jelentkező prototrof reverzió mértéke. 3. táblázat Körül-A szülőtörzsek genetikai markerei Prototrof rekombinánsok nyék Első szülő Második szülő száma milliliterenként 1 met arg 3,1 X 10* 2 met trp 4,8 x KP 3 arg trp 4,2 x 10* 4 met<I0' 5 arg-1,0 x 10' 6 trp<10‘ 4. példa A kísérletek során a Streptomyces fradiae (met) és a Streptomyces bikiniensis (nie ade) törzseket használjuk. A tenyészeteket az 1. példában megadott körülmények között tenyésztjük. Az eddig ismert módszerrel és a protoplaszt-fúzióval kapott genetikai kereszteződések számát a 4. táblázatban összehasonlítva adjuk meg. A 4. táblázat adataiból kiderül, hogy az ismert módszerrel összehasonlítva a találmány szerinti módon kivitelezett protoplaszt-fúzióval legalább 200-szor több az elérhető rekombinációs gyakoriság. 6
