189441. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Streptomyces és a Nocaradia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymásközötti genetikai információ cseréjére, protoplasztok fúzióvjával
189 441. 4. táblázat A fajok közötti vegetatív sejtekkel kivitelezett genetikai kereszteződés után és a protoplaszt-fúzió után kapott rekombinációs gyakoriság összehasonlítása 1. Vegetatív sejtek1 A. Rekombinációs gyakoriság Szuszpenzió Szelektált genetikai markerek nie ade met S. bikiniensis * S. fradiae S. bikiniensis - S. fradiae -1,1 X IO“8 < 5,9x IO'9 <1 x 10”’ <5,9x 10"9 <2,4x lo~* B. Rekombinációs analízis Nem szelektált A nie genetikai markerek Rekombinánsok szelektált száma marker A telepek stabilitása ade morfológiaja3 1 + 2 _ Sb 2 +Sb 3 +Sb 2. Protoplaszt fúzió4 A. Rekombinációs frekvencia Poli-Szelektált Szuszpenzió etiléngenetikai markerek glikol njc ade met S. bikiniensis x S. fradiae + 2,5* IU " 1,/x 10 ■ S. bikiniensis * S. „ fradiae <4,4 x 10 <4.4* 10 S. bikiniensis -<3.3 x 10 *<3,3 x 10 K S. fradiae -<4.4 x 107 B. Rekombinációs analízis A Nem szelektált Rekombi- Szelektált szelektált genetikai markerek nánsok genetikai genetikai nie ade a telepek száma marker marker morfolóstabilitása giája55 1 ade + 2 _ Sb 2 ade +Sb 3 ade +Sb 4 ade +Sb 5 ade +Sb 6 adeSb 7 ade +Sb 8 ade +Sb 9 nie + + Sb 10 nie + + Sb 10 15 20 ■10 50 ’A táptalajt és a genetikai keresztezés körülményeit Hopwood és Scrmonli szerint választottuk meg (Adv. Genet., 11,273 342.. 1962). 2Szclektív táptalajon való újraszélesztés után Tripticasc-szójás tápközegen 48 órán át tenyésztettük a rekombinánsokat, majd ultrahanggal kezeltük a tenyészetet, és hasonló táptalajon (amely agart tartalmaz) szélesztettünk. 4 napon át inkubáltuk a tenyészeteket, majd mindegyik rekombinánsból származó telepeket a kiválasztott genetikai marker jelenlétének vizsgálatára újraszelesztettünk. A + jel azt jelenti, hogy a vizsgálat pozitív, míg a - jel azt jelenti, hogy a vizsgált telep elvesztett a kiválasztott genetikai markert. 3Sb: Streptomyces bikiniensis morfológiája. 4A protoplasztok fúzióját P oldattal készült 40%-os polietilénglikollal indukáltuk (amit szűréssel sterilizáltunk). !Az összes Sb telep zorbamicint termelt. 5. példa A protoplaszt-fúziós módszert használva több fajon belüli genetikai kereszteződést tanulmányozunk. Egy éjszakán át az előnyös tenyésztési körülmények között növekedést meghatározó glicinkoncentráció mellett tenyésztjük a törzseket. Lizozimos kezeléssel (1 mg/ml) protoplasztokat izolálunk, a kezelés 30 °C hőmérsékleten 1-4 órán át tart. A kapott protoplasztokat összekeverjük, és P oldatban (lásd 1. példa) szuszpendáljuk. P oldattal (0,9 ml) készült 40%-os polietilén-glikol 6000 oldatot adunk a szuszpenzióhoz és sejtmembrán fúziójának indukálására. Kontrollként 0,1 ml protoplaszt szuszpenziót készítünk 0,9 ml P oldattal. A kezelt és nem kezelt protoplasztokat azonnal P oldattal hígítjuk, majd szelektív táptalajra szélesztjük őket (a táptalaj kazaminsavat nem tartalmazó R2 táptalaj). A következő törzseket használjuk: 5. táblázat Mikroorganizmus Fenotipus Streptomyces coelicolor 1190 his urea cap2 Nocardia erythropolis NE17-Streptomyces fradiae D6 met Streptomyces cinnamonensis 3823-A5 leu Streptomyces lipmanii A16884 >1 Streptomyces tenebrarius St26-A4 his Streptomyces lipmanii LA423 lys Streptomyces clavuligerus J1 UD3 Streptomyces cinnamonensis M2 UD Streptomyces aureofaciens S5 UD Streptomyces aureofaciens S15 UD Streptomyces candidus A35512-A1 antranilsav Streptomyces bikiniensis 241-44 nie ade Streptomyces fradiae SFA2 cys ’S. lipmanii protoplasztok az R2 táptalajon nem regenerálódtak. 2cap: 20 pg/ml klóramfenikollal szembeni rezisztenciát jelent; a többi genetikai marker auxotrofiát jelent. 3UD : nem meghatározott auxotrof táptalaj-igény. 7
