189441. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Streptomyces és a Nocaradia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymásközötti genetikai információ cseréjére, protoplasztok fúzióvjával
1 189 441 2 rocidicus (laidlomicin), S. lasaliensis (lasalocid), S, ribosidificus (lonomicin), S. cacaoi var. asoensis (lisocellin), S. cinnamonensis (monenzin), S. aureofaciens (narazin), S. gallinarius (RP 30504), S. longwoodensis (lizocellin), S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-l 1743a) és S. violaceoniger (nigericin). A glikopeptid-antibiotikumokat termelő Streptomyces és Nocardia fajok közül a következőket említjük : N. fructiferi (risztomicin), N. lurida (risztocetin), N. actinoides (aktinoidin), S. orientals és S. haranomachiensis (vankomicin); S. candidus (A- 35512, avoparcin) és S. eburosporeus (LL-AM 374). A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. 1. példa A kísérletekhez a Streptomyces fradiae auxotrof Al (Leu) és D6 (Met) mutánsait használjuk. 0,5 ml térfogatú folyékony nitrogénben tartott vegetatív sejtek szuszpenziójával 50 ml, a következő összetételű tápközeget oltunk: 0,4% glicin és 0. 4% maltóz. 18 órán át 37 °C hőmérsékleten levegőztetés közben percenként 250-et forduló rázóasztalon (kitérés 2,5 cm) tenyésztjük a mikroorganizmust. Centrifugálással mossuk a micéliumot, majd 20 ml P táptalajban (Okanishi és munkatársai, lásd előbb), amely milliliterenként 1 mg lizozimot tartalmaz, szuszpendáljuk. 2 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk a micéliális sejteket tartalmazó szuszpenziót, összekeverjük a kapott protoplasztokat, majd centrifugáljuk, és 1 ml P táptalajba szuszpendáljuk őket. Ezután 0,9 ml P táptalajban lévő különböző koncentrációjú polietilén-glikol 6000 oldatokat adunk (0,1 ml-t) a protoplaszt szuszpenzióhoz, a sejtmembrán fúziójának indukálására, Azonnal P táptalajjal hígítjuk a szuszpenziót, majd módosított R2 táptalajra (Okanishi és munkatársai, lásd előbb; 20% szaharózzal kiegészítve és kazaminsav nélkül) szélesztjük. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat A polietilén-glikol koncentrációjának hatása a rekomibináció gyakoriságára Re-Az adagolt Rekombi- kombi-Körül- Adagolt polietilénnánsok nációs meny protoplaszt -glikol száma gyakooldat ml-enként riság (%) A * ** 1 0,1 ml sejt + 0,9 ml 60% PEG" 4,3 x 103 2,2 2 0,1 ml sejt + 0,9 ml 40% PEG 5,9 x I03 3,0 3 0,1 ml sejt + 0,9 ml FS' 40% PEG 1,1 x 104 5,6 4 0,1 ml sejt + 0,9 ml FS 30% PEG 4,9 x 103 2,5 5 0,1 ml sejt + 0,9 ml FS 20% PEG 2,9 x 103 1,5 6 0,1 ml sejt + 0,9 ml FS 0PEG 1,9 x 102 0,1 A A prototrofok száma milliliterenként., túlélők száma milliliterenként *FS: szűréssel sterilizált (millipor, 0,45 mikron) **PEG : polietilén-glikol. A fenti kísérletet 40%-os szűréssel sterilizált polietilen-glikol oldattal megismételjük. A rekombinációs gyakoriság 3,5 x 104 rekombináns/ml. A rekombináns telepeket nem hipertóniás szelektív táptalajon újra szélesztjük, és vizsgáljuk stabilitásukat. A 10 vizsgált rekombináns közül az összes prototrof volt, ezt a tulajdonságukat megtartották (nem vesztették el a kiválasztott tulajdonságukat intenzív tenyésztéskor, amit nem szelektív körülmények között végeztünk). 2. példa A kísérletekhez Streptomyces fradiae auxotrof mutánsokat használunk. Legalább az egyik használt szülőtörzs két auxotrof markert tartalmaz, és spektinomycin-rezisztenciát (spc). Mindegyik genetikailag jelzett S. fradiae törzset Tripticase-szója táptalajon tenyésztjük, amelyhez 0,4% glicint adunk. Amikor a növekedés mértéke eléri az 1,5-5 optikai sűrűséget (kolorimetriásan 600 nm hullámhosszon mérve; Baush és Lomb készüléken) centrifugálással kétszer mossuk a micéliumokat, majd P táptalajban (Okanishi és munkatársai, lásd előbb) szuszpendáljuk. 1 mg és 2 mg/ml közötti mennyiségű lizozimot adunk a szuszpenzióhoz, 30 °C vagy 34 °C hőmérsékleten 0,5- 2 órán át inkubáljuk a szuszpendált micáliumokat. A kapott protoplasztokat (0,5 ml mindegyik szülőtörzsből kapott szuszpenzióból) összekeverjük. Centrifugálás közben többször mossuk a keveréket, miközben minden esetben P táptalajba szuszpendáljuk, végül 0,1 ml P táptalajban szuszpendáljuk a mosott sejteket. Ezután 0,9 ml P táptalajjal készült 40%-os polietilén-glikol 6000 oldatot adunk a szuszpenzióhoz a sejtmembrán-fúzió indukálására. A protoplasztok fúzióját fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáljuk. A fuzionált protoplasztokat az alábbi oldatok egyikében hígítjuk: 40% polietilénglikolt tartalmazó P táptalaj, P táptalaj vagy desztillált víz. A hígítás után R2 táptalajon (Okanishi és munkatársai, lásd előbb) szélesztjük a szuszpenziót, ahol megfigyeljük a rekombináció bekövetkezését és a rekombináns prototrof sejtek regenerálódását. Az R2 jelű táptalaj a prolin helyett aszparagint tartalmaz nitrogénforrásként. A rekombi nánsok számát 34 °C hőmérsékleten 10-24 napon át való inkubációt követően határozzuk meg. A prototrof rekombinánsokat egy nem szelektált marker (spektinomicin rezisztencia) jelenléte vagy hiánya szempontjából vizsgáljuk az egyszeres mutáns reverzió kizárására. A rekombináció bizonyítására további kontroli-kísérleteket végzünk. Ezután kiszámítjuk az összekevert protoplasztok eredeti számára vonatkoztatva a rekombinánsok számát; a protoplaszt szuszpenzió általában 10® és 109 közötti számú protoplasztot tartalmaz milliliterenként, amit közvetlen hemocitométeres számlálással határozunk meg. A 2. táblázatban adjuk meg több genetikai keresztezés összefoglalását, amit protoplaszt-fúzióval értünk el. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
