189407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliferáló növényi sejtformációk előállítására
1 2 , 189 407 ß) Kísérleti eredmények 1. példa: a Hyoscyamus muticus fajta, Vili B9 vonal (trp~) 105 sejtjének vagy 105 protoplasztjának 10 ml szilárdított A) táptalajban való lemezöntése után képződött sejttelepek száma Szilárdított B) táptalaj 0,4% agar 0,4% agaróz 0,8% agaróz Gélesitőszer nélkül Sejtek 20 nem vizsgáltuk 1024 1000 Protoplasztok 0 1102 472 120 Az 1. példa eredményei azt mutatják, hogy az agaróz úgy a sejtek, mint a protoplasztokból származó sejtek tenyésztésénél alkalmasabb az agamái, és hogy az agar a használt protopasztokra és sejtekre mérgezőleg hat. Sűrűség/ml alatt itt és az alábbiakban a tenyésztőközeg 1 ml-ében levő protoplaszt- vagy sejtszám értendő. 2. példa: Protoplasztszám/ml 50 000 10 000 felső réteg: azonos agaróz azonos agaróz Szilárdított A) táptalaj Agaróz 215 221 66 68 Tisztított agar 0 0 1 2 Agar 0 0 0 0 Gélesitőszer nélkül 48* * folyékony kontrollok 3,3* A következő 5. példa különböző agarózfajták elvi alkalmasságát mutatja Hyoscyamus muticus és dohány (VR2) fajták protoplasztjainák tenyésztésére, ami úgy magas, mint alacsony protoplaszt- 2o koncentrációnál megmutatkozik. A tisztított agar és az agar a ranglista végén áll, míg a Sea Plaque, a BRL-LMT-agarózok hasonló jellegzetességeket mutatnak és minden más vizsgált agarózfajtát jelentősen felülmúlnak. Ezzel szemben a tisztított 25 agar és az agar minden kísérletben lényegesen roszszabb eredményt ad az agarózoknál, és általában inkább fejlődésgátló hatást gyakorol a protoplasztokra. Dohány (VR2) protoplasztok lemeztenyésztésének hatékonysága növekvő hígításnál, B) tápközegben * 4 Sűrűség/ml : szilárdított 6000 3000 1000 300 35 B) táptalaj Agaróz formáció* 4,3 2,2 0,22 Agár formáció* 1,9 0 0 Gélesitőszer nélkül formáció* 1,3 0 0 40 * = Sejtformáció, melynek sűrűsége nem teszi lehetővé a sejtszámolást Amint az alábbi 4. példa Hyoscyamus muticus 45 (VIII B9 trp~) protoplasztfajta esetében világosan mutatja, az agar mérgező hatása legalább részben a tápközegben végbemenő diffúziós folyamatokra vezethető vissza, minthogy úgy az agar, mint a tisztított agar a rárétegzett agarózban gátolja a 50 sejtfejlődést. 4. példa: 55 Sejttelepek száma, melyek a Hyoscyamus muticus (VIII B9 trp-) fajta protoplasztjainak agarózzal ' vagy tisztított agarral vagy agarral alárétegzett, agarózzal gélesített vagy nem gélesített A) táptalaj 60 (össztérfogat 3 ml) vékony rétegében való lemeztenyésztése után képződtek 5. példa: A vizsgált agar- és agarózfajták kvalitatív használhatóságának rangsora a Hyoscyamus muticus és dohány (VR2) fajták protoplasztjaiból származó sejtkultúrák tenyésztésénél Rangsor Agaróz-tipus Előállító > 1 !/ Sea Plaque LMT Marine Colloids ,\IMP Bethesda Research Laboratories (BRL) 3 VII típus Sigma I aikalmas 4 HGT Sigma 6 HGTP, HGT, LE Marine Colloids 8 Standard LMT BioRad 9 Sea-Prep (0,8%)* 10 11 Tisztított agar Bacto-Agar az alkalmazáshoz Difco alkalmatlan, mivel gyakran mérgező * Minden próbát 0,8% és 0,4% [w/v] koncentrációnál hajtunk végre, mivel ezeknél a koncentrációknál már gél képződik. : A „Sca-Prep” csak 0,8% [w/v] felett gélesedik. A megszilárdult, protoplasztokkal beoltott táptalaj szegmentálásának a sejttenyészetek képződésére kifejtett hatását petúnia-protoplasztok, éspedig a „Mitchell” haploid segítségével vizsgáljuk. A szegmensek alapjául szolgáló táptalajokhoz gélesítő szerként agart, tisztított agart és agarózt alkalmazunk. Ugyanakkor összehasonlítjuk a szegmensekben levő sejtformációk mosását a Petri-csészékben hagyományos lemeztechnikával készített lemezekével. Amint a kővetkező 6. példa kísérleti eredményei mutatják, a protoplasztokból képződött 5
