189407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliferáló növényi sejtformációk előállítására
1 2 189 407 sejttelepek száma a szegmensekben mindig na- t gyobb, mint az átöblítő oldattal nem kezelt hagyományos lemezekben. Az összes vizsgált tápközeg közül az agarózt tartalmazó szegmensekben következik be a sejtformációk legerőteljesebb nőve- 5 kedése. 6. példa: Sejtformációk képződésének összehasonlító vizsgálata a hagyományos lemeztechnikával készült gélesített tápközegekben és a tápoldatba átvitt szegmentált formában. , A Petúnia hybrida „Mitchell” haploid sejttelepei- '5 nek %-os megoszlása; a telepek a megszilárdított tápközegben 2 hét múlva képződnek a protoplasztokból; a tápközeget vagy szegmensekre osztjuk fel és a tápoldatban* rázás közben tartjuk el, vagy felaprítás nélkül a Petri-csészékben hagyjuk. * C) tápoldat Sűrűség/ mi: 8x 10* 4x 10* 2x 10» Módszer lemez szeglemez szeglemez 25 mens mens mens Agaróz Tisztított 14,8 22,8 26,0 31,2 27,2 52,4 a % agar 3,2 14,2 6,2 8,4 7,4 10,6 Agár 2,6 5,4 2,2 3,2 0,12 i 0,81 30 A kísérlet egyértelműen bizonyítja, hogy a szegmentált agaróznak folyékony tápközegben való alkalmazása sokkal előnyösebb ^ tisztított agamái vagy az agamái, úgy lemezformában, mint szeg- 35 mentáit formában. Hasonló eredményeket kapuak például a Crépis capillaris fajta protoplasztjaival, a Petunia hybrida „Mutator Gens Potrykus” protoplasztjaival, a Brassica rapa fajta, a Lycopersicon esculentum faj- 40 ta, valamint a Nicotiana tabacum fajta protoplasztjaival. 7 7. példa 45 Növények regenerálása a Nicotiana tabacum fajta protoplasztjaiból A Nicotiana tabacum fajta körülbelül 5 x 10*/ml protoplasztját 1 % [w/v] agarózzal gélesített B) táp- 50 talajban [K3 táptalaj] diszpergáljuk és 10 napig lezárt Petri-csészékben a klímakamrában (fény: 3000 lux; hőmérséklet: 24 °C; levegőnedvesség : körülbelül 100%) tenyésztjük. Utána ezt a gélesített táptalajt egyforma nagyságú szegmensekre (1 cm 55 átmérő) osztjuk fel és a szegmenseket 0,25 mól szacharózt, 0,05 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, 2 mg/1 2-naftil-ecetsavat, 0,1 mg/1 6-benzil-aminopurint és 0,1 mg/1 kinetint tartalmazó módosított B) tápoldatba helyezzük és abban egyenletesen ráz- „ zuk. Egy hét múlva a B) tápoldatot megújítjuk, amikor is a szacharóztartalmat 0,2 mólra csökkentjük. A szegmens/tápoldat keveréket 4 hétig tovább rázatjuk és a tápoldatot minden héten megújítjuk. Végül a képződött sejttelepeket 0,2 mól szacharózt, 0,05 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, 2 mg/12-naftil-ecetsavat, 0,1 mg/1 6-benzil-amino-purint és 0,1 mg/1 kinetint tartalmazó, agarózzal megszilárdított D) tápközegre visszük fel. Ez a statikus tenyészet 4 héten belül kailusz-tenyészeteket képez, melyeket 0,2 mg/l 6-benzil-amino-purint tartalmazó, agarózzal megszilárdított D) táptalajra viszünk át, ahol egyedi sarjak képződnek. Az utóbbiakat agarózzal megszilárdított E) táptalajra visszük át és a gyökerek kialakulása után földbe ültetjük és érett növényekké neveljük fel. Szabadalmi igénypontok 4. Eljárás proliferáló növényi sejtformációk létrehozására, azzal jellemezve, hogy a) izolált protoplasztokat vagy protoplasztokból regenerált izolált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, és/vagy b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt szegmentáljuk, a szegmenseket tápoldatba visszük át és a tenyésztést mindkét esetben kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig folytatjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a) izolált protoplasztokat vagy protoplasztokból regenerált izolált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, vagy b) ezt az előkezelt és gélesített tápközeget szegmentáljuk, a szegmenseket növényi sejtszaporításra alkalmas 1-10 000-szeres térfogatú tápoldatba visszük át és a tenyésztést mindkét esetben 0° és 40 °C közötti hőmérsékleten kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig folytatjuk. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy manipulált protoplasztokat vagy már ismét regenerált sejtfallal rendelkező manipulált protoplasztokat tenyésztünk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzaljellemezve, hogy a manipulációk esetében gén-, sejtelemátültetést vagy sejtfúziót végzünk. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy inkubálási hőmérsékletként 12° és 30 °C közötti tartományt alkalmazunk. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szegmenseket térfogatuk 5-10 000-szeresét kitevő, növényi sejtszaporításra alkalmas tápoldatba visszük be. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szegmenseket térfogatuk 20-100-szorosát kitevő, növényi sejtszaporításra alkalmas tápoldatba visszük be. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az agarózzal megszilárdított primer tápközeg szegmentálását a protoplasztokkal való beoltása után 0-7 nap múlva hajtjuk végre. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szegmentálást a beoltást követő 3-4. napon hajtjuk végre. 6
