189407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliferáló növényi sejtformációk előállítására
1 189 407 2 halle, Svájc) oldunk és a Hyoscyamus muticus nemzetség auxotróf (csak életfontosságú vegyületeket tartalmazó táptalajban szaporodó) sejtvonalának (enyészetéből önmagában ismert módon előállított szuszpenziót protoplasztok nyerése céljából a fenti oldattal kezeljük. Az inkubálást sötétben, éjszakán át 26 °C-on hajtjuk végre. Ezután a keveréket acélszitán (pórusátmérő 100 pm) átszűrjük és a szűrletet azonos térfogatú 0,6 M szacharózoldattal hígítjuk. A hígított szűrletre 0,16 M CaCl2 • 2H20-t és 0,5% [w/v] MES-t (pH 5,6) tartalmazó oldatot rétegzünk és a képződött protoplasztokat a két réteg határfelületén összegyűjtjük, kétszer átmossuk a rárétegzésre használt oldattal és Gebhardt és munkatársai (Planta 153, 81-89 (1981)) szerint előállított B1 médiumban tároljuk. (A „B1 médium”-ot a továbbiakban A/ táptalajként jelöljük meg). b) Előírás: Nicotina tabacum VR2 sejtvonalának protoplasztjait Shillito és munkatársai (Mutat. Rés. 81, 165-175 (1981)) szerint izoláljuk. E protoplasztok tisztítását azonban úgy módosítjuk, hogy azokat az enzimtartalmú oldatban való inkubálás után 1/2 térfogat 0,6 M szacharózoldattal hígítjuk, a hígított keveréket az a) példa szerint az emlitettCaCl2-oldattal felülrétegezzük, a határfelületen a protoplasztokat összegyűjtjük, az említett CaCl2-oldattal mossuk, majd az a) előírás szerint járunk el és a protoplasztokat K3 médiumban (az alábbiakban B) táptalaj) tenyésztjük. c) Előírás: a haploid (egyszeres kromoszómasorozatot tartalmazó) „Mitchell” két Petúnia hybrida sejtvonalának - melyet M. Hanson (Charlottenville, VA, Amerikai Egyesült Államok) bocsátott rendelkezésre - és „Mutator-Gen Petunia” (Potrykus I., Z. Pflanzenzüchtung 63,24-40 (1970)) izolálása. Fiatal, teljesen kifejlődött leveleket 10 percig 0,01 % [w/v] HgCl2-ot és 3 csepp Tween 80-at tartalmazó 100 ml oldattal sterilezőnk és ötször desztillált vízzel mosunk. Mindig középér nélküli 6 levélfelet teszünk egymásra, izozmotikus oldattal (0,375 M mannit, 0,05 M CaCl2,0,5% [w/v] MES; pH 5,8) megnedvesítjük és vékony, 0,5 mm széles csíkokra vágjuk. Ezeket a csíkokat vákuumban átitatjuk az enzimoldattal (0,2% [w/v] celluláz Onozuka R. 10, 0,2% [w/v] macerozim; pH 5,6, a fenti izozmotikus oldatban). Az inkubálást éjszakán át, 12°C-on, sötétben hajtjuk végre. Végül a fenti izozmotikus oldat 1 térfogatát adjuk hozzá és a keveréket 10 pm pórusméretű szitán átszűrjük. A protoplasztokat kétszer mossuk az izozmotikus oldattal és a nem kívánatos melléktermékek kiküszöbölése céljából 0,6 M szacharózoldatot rétegzünk alája. A határfelületen kinyert protoplasztokat még egyszer tisztítjuk az izozmotikus oldattal és tenyésztő táptalajban (Durand és munkatársai szerint, Z. Pflanzenphysiol. 69, 26-34 (1973)) 12 óráig sötétben, 26 °C- on inkubáljuk. Az összehasonlító vizsgálatok alábbiakban közölt eredményei meggyőzően szemléltetik azokat a meglepő, előnyös kihatásokat, melyek (a) az agárnak agarózzal való helyettesítése és (b) az agarózzal gélesített tápközegek szegmentálása következtében növényi sejtformációk protoplasztokból való tenyésztésekor megfigyelhetők. Táptalajként agart és agarózt alkalmazó összehasonlító vizsgálatok példái a) Kísérleti körülmények Minden táptalajt ultraszűréssel (Nalgene-szűrő, pórusátmérő 0,22 pm) sterilezőnk. Gélesedő táptalajok előállítása céljából kétszeres töménységű tápoldat azonos térfogatát kétszeres töménységű és autoklávozott gélesítőszerrel keverjük össze. Folyékony tápoldatként például az A, B, C, D és E jelzésű alábbi tenyésztőközegek illetve tápoldatok alkalmazhatók: A) Komplett B1 médium : Gebhardt és munkatársai, Planta 153, 81-89 (1981). B) K3 médium: Nagy és Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78, 453-455 (1976). C) DPD médium: Durand és munkatársai, Z. Pflanzenphysiologie 69, 26-34 (1973). D) : Linsmaier, E. M. és Skoog, F. szerint, Physiologia Plantarum 18, 100-127 (1965). E) : Nitsch, J. P. és Nitsch, C. szerint, Science 163, 85-87 (1969). Gélesítő- és sűrítőszerekként az alábbiakat használjuk : 1. Agaróz: minden esetben „Sea Plaque LMT” (Marine Colloids). (Csak az alábbi 5. példái an leírt kísérletekben használunk további, ott megadott agarózfajtákat). 2. Agár: minden kísérletben Difco-Bacto-Agar. 3. Tisztított agar: 454 g agart (Difco-Bacl. Agár) egymás után 10 liter vízzel, 5 liter acetonr. il és 5 liter etanollal mosunk és vákuumban 4< C-on megszárítunk. Fehér, szagtalan port kapun Az a-c. előírások szerint kapott protopla íokat szokásos lemeztenyésztéses eljárással Petri-c* érzékben vékony rétegben beviszünk a gélesedő és tisztított táptalajokba. Az agart illetve agarózt - ityéb megjegyzés híján - 0,4% [w/v] koncentráltban használjuk. 6 cm átmérőjű Petri-csészékben mindig 3 ml táptalajt és 9 cm átmérőjű csészékben 10 ml táptalajt alkalmazunk. Azokban a próbákban, ahol agar- vagy agarózszegmenseket használunk, a protoplasztokat a tápközeg szegmentálása előtt a tápközegben egyenletesen eloszlatjuk. Végül a szegmenseket 30 ml tápoldatban 10 cm átmérőjű tartályokba tesszük és forgó-rázógépen 26 °C-on sötétben vagy világosban inkubáljuk és a folyékony tápközeget szabályos időközönként vagy folyamatosan cseréljük. A módszer használhatóságának illetve a protoplasztokból nyert sejttelepképződés előnyös befolyásolásának értékelését mikroszkóp alatt végezzük el 4-6 hetes inkubálási idő után. A mikroszkópos értékelésnél megfelelő mennyiségű látótérben leszámoljuk és megítéljük a képződött sejtformációkat. A szegmentációs kísérletekben a csészéket a bennük levő tápoldatban úszó szegmensekkel 14 napos időközönként lefényképezzük és kiértékeljük a szegmensekben látható sejtformációk számát és nagyságát. 5 10 15 20 25 30 3!> 40 45 50 55 60 4
