189287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G- és V-penicillin előállítására
1 189 287 2 A találmány tárgya: Eljárás G- és V-penicillin előállítására új Pénicillium chrysogenum URCM jelzésű 00 237 szám alatt deponált törzs (továbbiakban: URCM) süllyesztett kultúrás tenyésztésével az ezideig ismertnél magasabb, 250-450 E/ml/óra bioszintézis sebességet elérve. Ismeretes az a tény, hogy a penicillin-termelő Pénicillium chrysogenumnak az illető törzsre (mutánsra) jellemző optimális szénforrás fogyasztási sebessége van. Ez azt jelenti, hogy a különböző mutánsok különböző szénforrás fogyasztási sebességet tudnak elviselni anélkül, hogy bioszintézisük repressziós jelenségek folytán károsodást, szenvedne. [Chem. Abstr. 57 16 619 e.) 166 817 sz. magyar szabadalmi leírás; Bu’Lock, D. J.: The Biosynthesis of Natural Products. Me. Grav-Hill Publ. Co. Ltd. London. 1965]. Jelentős különbségek mutatkoznak az egyes termelésre alkalmazható mutánsok szénforrás-hasznosításában is. A kiemelkedő termelési eredményeket adó 180 399 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti LAR jelzésű törzs például fermentlé térfogatra számolt 1% szaharóz felhasználásával kb. 0,15% penicillint tudott előállítani. Ugyanakkor az eljárásunkban alkalmazott URCM jelzésű törzs 1 % szaharóz felhasználása esetén 0,18% penicillin bioszintetizálására képes. Jelentős különbségek mutatkozhatnak a gazdasági szempontból kiemelt fontossággal bíró fermentációs időben is attól függően, hogy az egyes mutánsok milyen sebességgel tudják felvenni a szénforrást úgy, hogy közben bioszintézisük represszióhoz hasonló jelenségek következtében le ne lassuljon, le ne álljon. A 180 399 sz. Magyar Szabadalomban védett LAR jelzésű törzs például 140 óra alatt képes kb. 11 % szacharóz felvételére és ebből kb. 1,6%, azaz kb. 26 000 E/ml fermentlé penicillin bioszintetizálására. Ugyanakkor az URCM jelzésű törzs 120 óra alatt kb. 2%, azaz 31 500 E/ml penicillint képes bioszintetizálni 11 % szacharóz felhasználása esetén. Tekintettel arra, hogy az URCM jelzésű törzs minden eddig ismertnél nagyobb bioszintézissebességet képes elérni, alkalmazása a fermentációk fajlagos anyagfelhasználásának csökkentésén túlmenően jelentősen csökkenti azok fajlagos energiafelhasználását is. Eljárásunk alapját az a felismerés képezi, hogy az URCM jelzésű Pénicillium chrysogenum törzsünk 120 órás fermentációban átlagosan 250 E/ml/óra bioszintézis-sebesség elérésére képes, maximális bioszintézis-sebessége pedig a fermentáció egyes szakaszaiban eléri a 450 E/ml/órá értéket is. Az URCM jelzésű törzs előállítása a következő módon történt: A Pénicillium chrysogenum LAR jelzésű törzséből spóraszuszpenziót készítve, a spóraszuszpenziót UV besugárzásnak vetettük alá. Az UV besugárzás után a túlélőkből szélesztményt és újabb spóraszuszpenziót készítettünk. Az újabb spóraszuszpenziót ismételt UV besugárzásnak vetettük alá és az egész folyamatot 17 esetben megismételtük. Az egyes besugárzások után nyert szélesztményekről telepeket izoláltunk és azok termelőképességét megvizsgáltuk. Az URCM jelzésű törzset a 17. UV besugárzást követő szélesztményből izoláltuk. (Az UV besugárzások utáni letalitás 86,3-99,9% közötti értéket mutatott.) A törzs leírása a következő: A Czapek agaron növesztett telepek 25 °C-on 6-8 nap alatt 18-30 mm átmérőjűvé fejlődnek. A telepek leírása Czapek agaron, 22 *C-on növesztve a következő: 30 nap múlva 28 mm átmérőjű (15 telep átlaga), halvány rózsaszínes drapp (átmehet 45. Buff és 61. Rosy-buff között, de halványabb és kifejezetten rózsaszín árnyalatú), kissé karélyos, sugarasan ráncos. Hátoldala rózsaszínes drapp (61. Rosy-buff). Exudatum nem keletkezik. Konidiumtartók, konidiumok nem képződnek, a telep micéliumból és vastag falú, fragmentálódott hifa sejtekből áll. Maláta agaron, 22 “C-on rendkívül lassan növekszik, 30 nap múlva 41 mm átmérőjű (15 telep átlaga), sárgás drapp szinű (64. Honey és 45. Buff közötti átmenet), sugarasan ráncos, szegélye ép. Konidiumtartók, konidiumok nem keletkeznek. A telep micéliumból, 8-11,5 mikron méretű puffadt sejtekből, valamint 10-35 * 19,5 mikron méretű vastag falú, fragmentálódott hifa sejtekből áll. A törzs a LAR jelzésű anyatörzstöl elütő bélyegei miatt morfológiailag is mutánsnak minősül. A telepekből előállított spóraszuszpenzió hántolt rizsen a rizs súlyára számított 1-2% földimogyoróliszt jelenlétében 24 óra alatt növekedésnek indul és a rizsszemeket 36 óra alatt teljesen beborítja. A spórázás 25 °C-on 60% relatív nedvesség tartása mellett 6 nap alatt fejeződik be. A 7. napon a spórák már másodlagos növekedést mutatnak. Az URCM jelzésű törzs megnövekedett termelőképességét a 3. és 4. számú példák mutatják be. 1. példa: A LAR 0190 jelzésű Pénicillium chrysogenum jelzésű törzsből 80 liter előfermentációt készítettünk. Az előfermentációt 630 liter alaptáptalajba oltottuk, melynek összetétele a következő volt : (Földi)mogyoróliszt 2,5 % Kukoricalekvár 100%-os 1,0 % Nátrium-tioszulfát 0,06% Kalcium-karbonát 0,78% Napraforgóolaj 0,28% A fermentációs paraméterek a következők voltak:- felhasznált energia:* 2,2 kW/m3- hőmérséklet. 25 °C- belső nyomás: 1,019 * 10® Pa A fermentációt 140 órán át futtattuk 25 °C-on. Ezalatt összesen 11 % szénforrást adagoltunk a tenyészethez (a szénforrás 8%-a napraforgóolaj, 92%-a szacharóz volt). A fermentáció során a fermentlé fenil-ecetsavtartalmát 0,05% értéken tartottuk folyamatos fenilecetsav adagolással. A pH szabályozására ammónium-szulfátot, ammónium-hidroxidot és ammónium-hidroxiddal párhuzamosan 1 :2 arányban kálium-hidroxidot alkalmaztunk úgy adagolva a fenti anyagokat, * a fermentációs folyadék kevertetéséhez felhasznált energia számértéke. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
