189286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejt- és szövetregeneráló anyagok előállítására
1 2 20 cm hosszú oszlopba töltjük. A 2 : 8 aranyú klo- mot elöntjük. Az oszlopot ezután 9 : 1 aranyu aceroform-metanol elegyben oldott anyagot az oszlop- ton-metanol-eleggyel öblítjük át és ez a frakció a ra felviszük, majd az oszlopot 200-200 ml 0,01 mó- kívánt glikolipidet tiszta állapotban tartalmazza, los nátrium-acetát-oldattal, 0,02 mólos nátriumacetát-oldattal és 0,2 mólos nátrium-acetát-oldattal 5 mossuk. A glikolipidet 2 : 8 arányú kloroform- Az anyag jellemzése metanol eleggyel eluáljuk. Az ily módon nyert eluált glikolipid az égési sebek gyógyulási idejét meg- A 2. példa szerint tisztított anyagot kovasavgélrövidíti. vékonyréteglemezeken történő kromatografálással 10 és metanol, kloroform és 0,196-os vizes kalciumklorid-oldat 55 :45 : 10 arányú elegyével végzett 5. példa eluálással választjuk szét. összehasonlító anyagként az alábbi anyagok ke- 200 ml, az I. példa szerint kapott eílen-dializátu- verékét együttesen szétválasztjuk: mot forgóbepárlóban vagy liofilezéssel szárazra pá- AsialogangliosidMI (a továbbiakban Asiarolunk és exikátorban foszfor-pentoxid felett leg- lo-GMI), Asialo-GM2, Asialo-GM3, Asiato-GDla, alább 3 órán át szárítunk. A szárított anyaghoz Cerebrosid és Psychosin. 15 ml frissen elkészített 20%-os piridines benzoe- Az Asialogangliosidok (GMI, GM2, GM3, GDlil) savanhidrid-oldatot, majd 15 ml 10%-os piridines 2Q kémiai összetételét és nomenklatúráját Handa S. és p-dimetilamino-piridin-oldatot adunk. Az edényt Kushi Y. [Advances in Experimental Medicine and át nem eresztő módon lezárjuk és 2 órán 37 °C-on Biology 152, 23-31 (1982)], míg a Cerebrosid és inkubáljuk. Az edényt lehűtjük és tartalmát az old- Psychosin kémiai összetételét és nomenklatúráját hatatlan anyagtól szűrőn vagy centrifugálással el- Burton R. M. [„Glycolipid Methodology", kiadó: választjuk. , , . . 25 American Oil Chemists' Society, Champaign (IL, A piridint nitrogén-áramban eltávolítjuk és a USA), 1—11 (1976] írták le. száraz ányagot 30 ml hexánban felvesszük. A he- a lemezek színezését az alábbi módszerekkel véxánt 3 x 18 ml lúgos metanolos vizes oldattal mos- gezzük el: suk (ez 0,4 g nátrium-karbonát 100 ml, 80 : 20 ará- 1. 20 mg Krezil-ibolya, 1000 ml I %-os ecetsavnyú metanol-víz eleggyel képezett oldatából áll). ban, kék-ibolya színeződés. A hexános fázist nitrogén-atmoszférában szárítjuk, 2. 1% difenilamin 2 ml etanol, 100 ml tömény majd 4% etilacetátot tartalmazó hexánban felvesz- sósav és 80 ml ecetsav elegyében; vörös színeződés. sz“k. 3. Előbb 5,25% hipoklorossavat 40 ml benzol és A per-O-benzoilezett glikolipidet nagy nyomású 5 mi ecetsav elegyében permetezünk a lemezre, száfolyadék-kromatográfiás kovasavgél-oszlopon kro- rítószekrényben 60 °C-on szárítjuk, majd 1 % benzimatografáljuk és 4%-tól 45%-ig terjedő etilacetát din 50%-os etanollal képezett oldatával kezeljük; gradiens szerint hexán-etilacetát elegyekkel eluál- kék színeződés. juk-......................... 4. 0,1 g orcinol Imi 1 %-os vas(III)klorid-oldat Az eljárás során izolált per-O-benzoilezett-gliko- és 50 ml víz elegyében, barna színeződés, lipidet a benzoilcsoportok eltávolítása céljából 5. A vékonyréteglemezeket kamrában jódgőzök 0,6 n nátrium-hidroxid-oldattal 1 órán át 37 C-on hatásának tesszük ki. Az összehasonlító anyagok és hidrolizáljuk. A hidrolizátumot 5 térfogat aceton- az analizálandó minta (Rrérték 0,65) sárgán elszínal elegyítjük és a kiváló natív glikolipidet szüljük néződnek vagy centrifugáljuk. , . 6. 254 nm és 366 nm hullámhosszon fluoreszkáló A fenti eljárással tisztított glikolipid égési sebek indikátorral kezelt vékonyréteglemezek felhasznágyógyulási idejét megrövidíti. ]ása. esetén a fluoreszcenciát a 0,65 Rf-értéknek megfelelő analizálandó anyag nem gyengíti ; hasonlóképpen az összehasonlító anyagok sem változtat-6. példa ják a lemezek fluoreszkálását. .... , c0 7. 0,2% naftorezorcin acetonban és 10%-os fosz-Az 1. példa szerint kapott dializatumot 9 térfogat forsavban. A fenti permetező reagenssel kezelt leetanollal elegyítjük és 30 percen át 85 °C-on kever- mezeket 5 percen át 90 °C-on melegítjük ; kék-vörös jük. A keletkező csapadékot szűrőpapíron leszűr- színeződés jük és az átlátszó oldatot 3 napon át -20 C-on g j g anjzjcjin 100ml 70%-os etanolban; kék állni hagyjuk. A kívánt anyag kiválik és ez alatt az színeződés. idő alatt leülepedik. A felül elhelyezkedő folyadé- 55 kot dekantáljuk, az üledéket 2 : 1 arányú kloro- ! form-metanol elegyben felvesszük és acetát-formában levő dietilaminoetil-Sephacel-oszlopra felvisz- Minőségi és mennyiségi meghatározás szűk. Az oszlopot 2 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk, az eluátumot összegyűjtjük, majd 60 1 ml, a 2. példa szerint tisztított anyagot forgóbeforgóbepárlóval betöményítjük és a maradékot párlón vákuumban 37 “C-on vagy liofilizálással kloroformban oldjuk. Az oldatot aktív kovasavgél- szárítunk. A szárított anyagot 0,8 ml 2 mólos kénlel kloroformban töltött oszlopra visszük fel. Az sav és 0,4 ml dioxán elegyében felvesszük és az oszlopot előbb kloroformmal, majd 9 : 1 arányú ampullákat lezárjuk. A mintát 3 órán át 95 °C-on kloroform-metanol eleggyel átöblítjük és az eluátu- 65 hidrolizáljuk, majd 0,14 ml 10 n nátrium-hidroxid-189 286 6
