189286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejt- és szövetregeneráló anyagok előállítására
1 189 286 2 5. kísérlet Sejttenyészetek (pl. növekvő fibroblastok) növekedését oly módon gátolhatjuk, hogy a tápanyaghoz nem adunk nátrium-hidrogén-karbonátot. A 2-6. példában leírt anyagokat a táptalajhoz hozzáadva a sejtek a fenti gátló hatás alól hamarabb felépülnek és normális osztódási tevékenységüket lényegesen hamarabb érik el, mint a megfelelő gátolt és kezeletlen sejttenyészetek. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. A példákban az oldószer-elegyekkel kapcsolatban közölt számadatok térfogatrészekre vonatkoznak. így pl. a 3 : 1 arányú éter-etanol-elegy 3 térfogatrész éter és 1 térfogatrész etanol elegyének felel meg. I. példa Vágóhídon leölt borjúk véréhez a vágás helyén azonnal 20% koncentrációban etanolt adunk és a vért 0,02% bakteriosztatikus hatású p-hidroxibenzoesav-metilészterrel (Metilparaben) és phidroxi-benzoesav-n-propilészterre! (Propilparaben) kezeljük. A vért szobahőmérsékleten 3 napon át autolizáljuk; ez alatt erős hemolízis és a nem stabil komponensek részleges lebomlása játszódik le és a membránokból a membránkomponensek kioldódnak. A kapott autolizátumot az üledéktől dekantálással elválasztjuk és a felül elhelyezkedő folyadékot 3 napon át statikusan vagy dinamikusan 10 000 kizárás határú membránon át dializáljuk. A dinamikus dialízis során a dializátumot és az ellen-dializátumot 3 napon keresztül ellenáramban szivattyúzzuk át a dialízis membránon és ily módon végig a lehető legnagyobb koncentráció-esést biztosítjuk. A kapott ellen-dializátum szárazanyag tartalma 5-80 mg/ml és 1 mg/ml értékig terjedő mennyiségben tartalmaz sebgyógyulást elősegítő hatóanyagokat. A leírásunk elején idézett európai szabadalmi bejelentés szerinti eljárással a glikoszfingolipidek 0,005 mg/ml koncentrációban állíthatók elő. 2 2. példa 2 liter borjúvért 300 ml etanollal elegyítünk és 3 napon át szobahőmérsékleten autolizálunk. Az autolizátumot az 1. példában leírt módon dialízisnek vetjük alá. A kapott ellen-dializátumot 6 liter 3 : 1 arányú etanol-éter eleggyel összekeverjük és ekkor főként glikoszfingolipidekből álló csapadék keletkezik. A lecsapott anyagot 18 000 g mellett 30 percen át végzett centrifugálással ülepítjük és a folyékony fázistól elválasztjuk. A csapadékot vákuumban 37 °C-on szárítjuk és 20 ml 65 : 35 arányú kloroform-metanol elegyben oldjuk. Az oldott glikoszfingolipideket 5,0 cm átmérőjű és 40 cm hosszú, 65 : 35 arányú kloroformmetanol eleggyel egyensúlyba hozott Florisil oszlopon (védjegy, magnézium-szilikátgél, a Floridin Corp. Pittsburgh PPA, USA cég nagyszelektivitású abszorbense) kromatográfiás úton szétválasztjuk és a maradék foszfolipideket eltávolítjuk. A glikoszfingolipideket 2-2 liter, 35%, 50% és 75% metanoltartalmú kloroform-metanol elegyekkel emelkedő metanol-gradienssel, végül 100%-os metanollal elüáljuk. Az eluálási lépéseknél kapott anyagokat a korábban leírt sebgyógyitási tesztekben kipróbáljuk. Azt találtuk, hogy az utolsó, 100%-os metanollal eluált frakció a sebgyógyulást meggyorsító anyagokat tartalmaz. Az ily módon nyert frakcióban levő anyagokat 2 mm rétegvastagságú preparatív kovasavgélvékonyréteglemezekre visszük fel és 55 :45 : 10 arányú kloroform : metanol :0,l%-os vizes kalcium-klorid-oldat elegyben, 18cm-es szakaszon felfelé áramolva kromatografáljuk. A lemezeket kromatografálás után szárítjuk és rövid ideig jóddal telített légkört tartalmazó kamrába helyezzük. A sárgán elszíneződő zónákat megjegyezzük, a jód szublimálása után kikaparjuk és icovasavgélen 50 : 50 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. A fenti vékonyréteg-kromatográfiás elválasztási eljárásnál nyert, 0,65 Rf értéknek megfelelő frakció patkányon az égési sebek gyógyulási idejének megrövidítését vizsgáló kísérletben pozitív eredményt ad. 3. példa Az 1. példa szerint előállított, 2 liter térfogatú ellen-dializátumot forgóbepárlóban vagy liofilizálással beszárítunk és tetrahidrofurán és 0,01 mólos kálium-klorid-oldat 4 : 1 arányú elegyében felveszünk. Az oldhatatlan anyagot papírszűrőn elválasztjuk és az átlátszó oldatot forgóbepárlón 500 ml-re bepároljuk. A maradékhoz 1 liter 2 : 1 arányú kloroform-metanol elegyet adunk, majd a szerves és vizes fázist 200 ml víz hozzáadásával elválasztjuk. A glikolipideket tartalmazó felső fázist elválasztjuk és szárazra pároljuk. A száraz anyagot kloroform-metanol-víz 90 : 10 :0,2 arányú elegyében (10 ml) oldjuk és 1,5 cm átmérőjű, 120 cm hosszúságú, 90: 10: 0,2 arányú kloroform-metanol-víz eleggyel egyensúlyba hozott oszlopra viszszük fel. Az oszlopot 1,5 liter fenti összetételű futtatóeleggyel mossuk és a lipideket 1 liter 85: 15:0,2 arányú kloroform-metanol-víz eleggyel eluáljuk. Az ily módon tisztított anyag az égési sebek gyógyulási idejét megrövidítő glikolipid. 4. példa 2 liter, az 1. példa szerint kapott ellen-dializátumot 6 liter 3 : 1 arányú etanol-éter eleggyel összekeverünk, mikoris túlnyomórészt glikoszfingolipidekből álló csapadék keletkezik. A csapadékot 18 000 g sebességgel történő centrifugálással 30 percen át ülepítjük és a folyékony fázistól elválasztjuk. A csapadékot vákuumban 37 °C-on szárítjuk és 20 ml 2 : 8 arányú kloroform-metanol elegyben felvesszük. Cl'-formában levő dietilaminoetil-SephadexA50-t 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal és 1 n ecetsavval történő mosással acetát-formába viszünk, metanollal mossuk, majd 2,5 cm átmérőjű és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
