189286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejt- és szövetregeneráló anyagok előállítására
1 I 189 286 . 2 mázzuk; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy növekvő polaritású oldószer-elegyeket használunk és a kvantitatív összetételt lineáris, konkáv vagy konvex vagy lépcsőzetes gradiens szerint változtatjuk. 5 Az eluátum-frakció glikolipid-tartalmát és tisztaságát különböző módszerekkel határozhatjuk meg. E célra a kísérleti részben leírt, glikolipidekre vagy glikosphingolipidekre jellemző színreakciókat és színezési módszereket alkalmazhatunk. A frak- 10 ciókat pl. kovasavgéllel, C,g-alkán-származékokat tartalmazó kovasavgéllel, poliamiddal, cellulózzal vagy poliakril-amiddal bevont vékonyréteglemezeken vagy -fóliákon, megfelelő futtatószerben további szétválasztásnak vethetjük alá. A szétválasz- 5 tott anyagokat nem vizes oldószerrel (pl. kloroform és metanol elegyével) eluáljuk a lemezről vagy fóliáról és vékonyrétegkromatográfia, a hidrolizált terméket hidrolízise és elemzése, gázkromatográfia, 2Q tömegspektrum, az emlősök felületi sérülései gyógyulási idejének megrövidítése vagy a sejttenyészetek viselkedésének megfigyelése útján vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a hatóanyagok a glikoszfingolipidek szerkezetének felelnek meg. Az alábbiakban ismertetésre kerülő farmakológiái kísérletek igazolják, hogy az előállított hatóanyagok egyrészről előkárosított fibroblastokra in vitro kifejezett burjánzáselősegítő hatást fejtenek ki, másrészről a megfelelő sejttenyészetekre in vivo regenerálódást elősegítő hatást gyakorolnak. E hatóanyagok esetében egyértelmű, hogy nem csupán szokásos mitotikus hatású anyagokról van szó, minthogy a normál egészséges sejttenyészetek e hatóanyagok hozzáadásakor semmilyen elváltozást nem mutatnak. Ezzel szemben az abnormálisán alacsony osztódási arányt mutató, különböző károsító ágensekkel elökárosított tenyészeteket e hatóanyagok rövid időn belül ismét az egészséges tenyészettel gyakorlatilag azonos osztódási arányra állítják vissza. Minthogy a találmányunk szerinti eljárással előállított hatóanyagok a károsított sejtpopulációk regenerációs mechanizmusát in vitro és in vivo körülmények között egyaránt helyreállítják, ezeket a hatóanyagokat a gyógyászatban különösen lassan 45 vagy nehezen gyógyuló, kis gyógyulási készségű sebek vagy fekélyek kezelésére alkalmazhatók. A találmányunk szerinti eljárással előállított anyagok sebek gyógyulására kifejtett hatását az alábbi kísérletekkel igazoljuk: 50 I. kísérlet Narkotizált patkányok szőrzetét eltávolítjuk és 55 a törzs mindkét oldalán 2 cm átmérőjű, 270 °C hőmérsékletű tárcsa 30 másodpercen át történő rányomásával égési sebeket ejtünk. A hatóanyagot zselé-alapanyagba bedolgozva 20%-os hatóanyagtartalmú zselét használunk. Kontrollként vizet 60 vagy fiziológiás nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk. 10-10 állatot (minden állaton két sebet ejtettünk) a zselével naponta kétszer helyileg kezelünk és megállapítjuk a gyógyulás befejeződéséig eltelt időt. A 2. példában leírt, Rf=0,65 értéknek megfe- 65 lelő anyag a kontroli-csoporthoz viszonyítva a gyógyulási időt 21%-ig megrövidíti. 2. kísérlet Minisertések hátán az 1. kísérletnél leírt módon négy égési sebet ejtünk és 2,5 cm átmérőjű, üreges hengeres fúróval 4 lyuggatott sebet ejtünk. A hatóanyagokat 20%-ig terjedő koncentrációban dolgozzuk be a zselé-alapanyagba. A sebeket naponta kétszer bekenjük a zselével és meghatározzuk a seb teljes gyógyulásához szükséges időt. A 0,65 Rrértéket mutató anyag a gyógyulási időt 18%-kal csökkenti. 3. kísérlet Minisertéseken az 1. kísérletnél leírt módon égési sebeket ejtünk. A kezelt csoportok állatait naponta kezeljük és a csoportokból 6, 12, 18 és 22 nap után állatokat kiválasztunk és narkózisban leölünk. A sebeket kivágjuk, kettéosztjuk és 4%-os pufferolt formáimnál fixáljuk. A szövetdarabokból 4 p vastagságú hisztológiás paraffin-metszeteket készítünk. Az alábbi paramétereket kvantitatív meghatározzuk : 1. A hámosodott sebfelület hossza. 2. A nem hámosodott sebfelület hossza. 3. A felhám Stratum basale hosszúsága. 4. Az újonnan képzett felhám felülete. 5. A szőrtüszők és faggyúmirigyek felülete. A fenti paraméterek kiértékelése azt mutatja, hogy a 2-6. példák szerint tisztított anyagok a felhámosodást és a felhám immigrációját a kontroli-állatokhoz képest gyorsítjuk. A sebgyógyulást gyorsító hatás túlnyomórészt a Stroma, Stratum basale és szemölcsök képződésének kezdeti szakaszában jelentkezik. 4. kísérlet Narkotizált patkányokon 1 cm széles és 5 mm mély szúrt sebeket ejtünk. A sebekbe viszkóz-cellulóz-üregeshengert tartalmazó szivacsot helyezünk. Az üregeshenger belső üregébe naponta 100 1 tisztított hatóanyagot juttatunk. Az implantáció utáni 4., 10., 16. és 21. napon a szivacsokat kivesszük és a haemoglobin-, dezoxiribonukleinsav- és hidroxiprolin-tartalmat meghatározzuk. A tisztított hatóanyagokkal kezelt sebek esetében az implantáció utáni 4. és 10. napon implantált szivacsokban levő haemoglobin-, dezoxiribonukleinsav- és hidroxiprolin-tartalcm nem nagyobb, mint a kontroli-állatok esetében; a 16. és 21. napon azonban a szivacsokban a haemoglobin-, DNS- és hidroxi-prolintartalom lényegesen magasabb. A módszerek leírása az alábbi irodalmi helyen található: Niinikoski J. és RenvallS.: Acta Chir. Scand. 145 (1979), 287-291. A 2. és 6. példa szerint tisztított hatóanyagok a sebgyógyulást a Stroma és Stratum basale korábbi kialakításával kapilláris úton gyorsítják. 4
