189251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására
1 189 251 2 protamin sóként pedig a protaminok sósavas, kénsavas és foszforsavas sói jöhetnek szóba. A felsorolt protaminok és p rőt amim ók között nem észlelhető számottevő különbség a TNF stabilizáló képesség tekintetében. A találmány szerinti stabilizáló szerek külön-külön vagy keverékként is alkalmazhatók. A találmány értelmében a hozzáadott stabilizátor mennyisége 10 pg és 5 mg között van a TNF oldatban milliliterenként, amelynek TNF aktivitása 102 és 109 egység/ml közötti (az aktivitás egységét később definiáljuk). A stabilizálószer alkalmazható maximális menynyiségét a stabilizálószer oldhatósága, a keletkező oldat viszkozitása, valamint gazdasági megfontolások szabják meg. A stabilizálószer hozzáadásának módja nem lényeges. Poralakú stabilizátor például közvetlenül hozzáadható a TNF oldathoz. Úgy is eljárhatunk, hogy a stabilizálószer porát előbb feloldjuk vízben vagy valamilyen alkalmas puflferben és így adjuk a TNF oldathoz. A stabilizátor a tisztítási eljárás bármely lépésekor vagy a gyógyszerkészítés során is hozzáadható. Ha két vagy több különböző stabilizátort alkalmazunk, akkor együttes mennyiségüknek kell a fentiekben ismertetett koncentráció határok közé esni. Kívánatos, hogy a stabilizálószert tartalmazó TNF oldat tárolása, tisztítása és a belőle való gyógyszerkészítés 0 és 30 °C, előnyösen 0 és 10 *C közötti hőmérsékleten történjen. Ha a TNF oldatot fagyasztva tároljuk, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 0 °C alatti, még előnyösebben pedig - 20 °C alatti legyen. A TNF oldat, amely a találmány értelmében legalább egy stabilizálószert tartalmaz, megtartja aktivitását a tárolás, tisztítás és gyógyszerkészités során, akár oldat formájában van, akár pedig fagyasztott állapotban. A találmány értelmében a TNF stabilizálására szolgáló eljárás alkalmazható a fagyasztva szárítás során is. Példaként említettük, hogy a fagyasztva szárítás során a TNF oldat (különösen hogyha nagy tisztaságú TNF-ről van szó) aktivitása általában jelentősen csökken. Azok a TNF oldatok azonban, amelyek a találmány értelmében legalább, egy stabilizálószer fent említett mennyiségét tartalmazzák, aktivitásveszteség nélkül fagyasztva száríthatok TNF porrá. Stabil TNF oldat készíthető az olyan TNF por vizes oldásával, amelynek TNF és stabilizátor koncentrációja a fent meghatározott tartományba esik. A találmány szerint a stabilizálószert a fagyasztva szárított készítmények is tartalmazhatják. Ha a TNF poralakban kerül tárolásra, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 25 °C vagy alacsonyabb legyen. • A TNF aktivitásának meghatározására általában két módszer használatos; az in vivo módszer, amelynek során a tumor nekrotizáló hatást in vivo mérik; valamint az in vitro eljárás, amelynél a neoplasztikus sejtekre gyakorolt citotoxikus hatást in vitro mérik. In vivo módszerként említhetjük például a Carswell és munkatársai által alkalmazott eljárást [Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (9) 3666-70 (1975)]. E módszer szerint BALB/C Szarkóma Meth A sejteket (2 x 105 sejt) intradermálisan átültetnek (BALB/C x C57BL(6)F, egerek hónaljába, majd 7 nap elteltével a 7-8 mm átmérőjű, jó vérellátású, spontán központi nekrózistól mentes tumorral rendelkező egereket választják ki az értékeléshez. Fiziológiás sóoldattal hígított TNF mintát (0,5 ml) injektálnak mindegyik egér farokvénájába. A TNF minta aktivitását 24 óra elteltével az alábbi kritériumok szerint értékelik: ( - ): nincs változás ( + ): enyhe haemorrhagiás nekrózis ( + + ): mérsékelt haemorrhagiás nekrózis (a tumor felületének kb. 50%-ára kiterjedő központi nekrózis) (+ + +): jelentős haemorrhagiás nekrózis (erőteljes nekrózis, amely csak a tumor peremén hagy keskeny életképes szegélyt). TNF aktivitás mérésinek in vitro módszerei közül például a Ruff és munkatársai‘[Lymphokines, Vol. Z. Ed. by E. Pick, Academic Press, New York, 245-8 (1980)], valamint a Kuli és munkatársai [J. Immunol. 126 (4) 1279-83 (1981)] által alkalmazott eljárásokat említhetjük. A feltalálók által használt, a TNF aktivitását in vitro mérő módszert a fent említett hagyományos módszerek tökéletesítésével fejlesztették ki. Ez az in vitro eljárás, amely az L-M sejtekre (ATCC CCL 1. 2) gyakorolt citotoxikus TNF aktivitást méri a következőképpen végzendő el. Tenyészrésre szolgáló edényként 96 lyuku mikroliter tálcákban (Floww Laboratories Inc. USA), 10% hőinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó Eagle minimál táptalajon [Science 130 432-7 (1959)] szaporítjuk el az L-M sejteket. A TNF mintákból (0,1 ml) sorozathígításokat készítünk a táptalajjal és L-M sejtszuszpenzióval (0,1 ml, 1 x io4 sejt)elegyítjük őket a tálcák lyukjaiban, majd a tálcákat 37 °C-on, 5% széndioxid tartalmú légtérben 48 órán át inkubáljuk. A tenyésztési periódus befejeztével 20 pl 20%os vizes glutáraldehid oldatot adagolunk a lyukakba a sejtek rögzítésére. A rögzítés után a tálcákat desztillált vízzel mossuk, azután száradni hagyjuk őket, majd 0,05%-os metilénkék oldat (0,1 ml) hozzáadásával megfestjük az élő sejteket. A színezék feleslegét alapos, desztillált vizes mosással eltávolítjuk, majd a tálcákat száradni hagyjuk. A megfestett sejtekből ezután extraháljuk a színezéket a lyukakba 3%-os sósavoldatot (0,2 ml) juttatva. A minták adszorpcióját 665 nm-en megmérve (Titertek Multiscan, gyártja Flow Laboratories Inc.) az élő sejtek számával arányos jelet kapunk. A TNF aktivitást [egység (E)/mlj az 50%-os citotoxieitást eredményező hígítás reciprokaként definiáljuk és oly módon kapjuk meg grafikusan a mérési eredményekből, hogy a hígítást az adszorpció függvényében ábrázoljuk. Valamennyi, a későbbiekben közölt, in vitro módszerrel meghatározott TNF aktivitás az igy definiált egységben értendő. A találmány szerinti módszerrel a klinikailag alkalmazható hatásos antitumor gyógyszernek tartott nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó kereskedelmi ellátás biztosítható, mivel ennek alapján lehetővé válik a TNF aktivitásának megőrzése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
