189251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására
1 189 251 2 a tárolás (oldat, fagyasztott vagy fagysztva szárított készítményként), tisztítás és gyógyszerkészítés során. Ezen kívül úgy találtuk, hogy a TNF oldat vagy por, amely legalább egy - humán szérumalbumin, zselatin, humán gamma globulin vagy ennek származéka, protamin vagy protaminsó közül választott - stabilizáló szert tartalmaz, biztonsággal bejuttatható az emberi szervezetbe, és ennek következtében a találmány szerinti új összetételű készítmény különösen előnyös midőn a TNF-et antitumor gyógyszerként klinikailag kívánják alkalmazni. A találmányt a következő példákban részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány tárgykörét ezzel korlátoznánk. A példákban használt rövidítések: A következő példákban a stabilizálószerek rövidítései: HSA: humán szérumalbumin BSA: marha szérumalbumin PHG-1: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin lúgos hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly: kb. 7000) HGG: humán gamma-globulin ~ SPS: lazac protamin-szulfát HPS: hering protamin-szulfát BGG: marha gamma-globulin CEA: csirke tojásalbumin BLA: marha a-laktalbumin PHG-2: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin savas hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly kb. 7000) PHG-3: alacsony polimerizációs fokú részlegesen hidrolizált zselatin PG: tisztított zselatin SPF: lazac protamin (szabad bázis) SPP: lazac protamin-foszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav Referencia példa 2-3 kg súlyú nőstény nyulakba 75-75 mg formaiinnal elölt Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) sejttömeget injektáltunk intravénásán. Nyolc nap elteltével a nyulakba intravénásán 100-100 pg endotoxint (Escherichia coli 026: B6 lipopoliszacharidot, a Difco Laboratories, USA terméke) injektáltunk. Két órával ezután a nyulaktól szívből vért vettünk, kévés heparint kevertünk hozzá, majd 3000/perc fordulaton 15 percen át centrifugáltuk. így 2500 E/ml TNF aktivitású plazmát kaptunk. Ezt a TNF tartalmú plazmát (10 liter) 5 liter mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) hígítottuk és 0,13 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) egyensúlyba hozott DEAE - Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals AB , Svédország terméke) oszlopra (10 x 42 cm) vittük. Az oszlopot 2,5 liter 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (ph 7,8) mostuk, majd a megkötött TNF elucióját lineáris NaCl gradienssel végeztük a következő két oldattal: 5,0 liter 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8), illetve 5,0 liter 0,3 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 230 ml/óra volt és 45 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitás a 0,20 és 0,24 mól/1 NaCl koncentrációtartományban lejövő frankciókban volt. Ezeket egyesítettük és éjszakán át 0,13 mól/1 NÁCI tartalmú 0,03 mól/1 Tris/HCl pufferrel (pH 7,2) szemben dializáltuk. A dializált TNF oldatot újra kromatografáltuk 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCl pufferrel (pH 7,2) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B oszlopon (3,0x30 cm). Az adszorbeált TNF-et lineáris NaCl gradienssel eluáltuk, a határoldatok: 500 ml ekvilibráló puffer, illetve 0,3 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCl puffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 40 ml/óra volt és 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A TNF aktivitással rendelkező frakciókat egyesítettük és töményítettük. Ezt a koncéntrátumot 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 5 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) ekvilibrált Sephacryl S-200 (Pharmacia termék) oszlopon (5 x 100 cm) gélszűrtük. Az eluciót a kiegyenlítő pufferrel végeztük. Az átfolyási sebesség 80 ml/óra volt és 13 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük és ultraszüréssel töményítettük. Az így kapott TNF oldat 5,0 x 10s E/mg fehérje fajlagos aktivitású és a plazmához viszonyítva tízezerszeres tisztaságú. Ezt a TNF oldatot ugyanazon az oszlopon (Sephacryl S-200) ugyanazzal a pufferrel újra kromatografálva 1 x 10e E/mg fehérje fajlagos aktivitású TNF oldatot kaptunk. 1. példa 5,0 x 105 E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1200 E/ml aktivitású TNF oldatot készítünk. Az így kapott oldat alikvotjaihoz különkülön stabilizálőszereket (HSA, BSA, PHG-1, HGG és SPS) adtunk kétféle koncentrációban (0,1, illetve 1,0 mg/ml). Az oldatok maradék aktivitását a következő kezelések után meghatároztuk; i) tárolás 4 °C-on 2,7 illetve 30 napig; ii) fagyasztás (-70 °C) és felolvasztás egyszer illetve háromszor; iii) fagyasztás —70 °C-ra, fagyasztva szárítás és tárolás 25 *C-on 7 napig. A fenti kísérletek során a stabilizátor nélküli TNF oldat volt a kontroll. A fagyasztva szárított készítményből (iii) a TNF aktivitás meghatározásához steril desztillált vizes oldatot készítettünk. A maradék aktivitás meghatározása a korábban ismertetett in vitro illetve in vivo módszerekkel történt. Az in vitro módszerrel a maradék aktivitást (%) a mérési adatokból az alábbi képlet szerint kaptuk: Maradék aktivitás (%) = ^ x 100 B ahol A a TNF minta aktivitása a kezelés után, B pedig a TNF minta aktivitása a kezelés előtt. Az in vivo meghatározáshoz a mintákat a kezdetihez képest 20-szorosra töményítettük Mini-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
