189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
1 2 189 246 cél-antigénjét. Lehetséges ezeket a sejteket trinitrofenil-hapténnel (TNP) jelezni, a 78 27 838 számú korábbi bejelentésben leírtak szerint. Az említett haptént a vizsgált immuno-enzim konjugátumban levő anti-DNP antitest tökéletesen felismeri és ilyen módon megalkotja a modell második cél-antigénjét. Bebizonyosodott, hogy a sejtek jelzése TNP hapténnel nem váltóztatja meg a sejtek életképességét és nem zavarja meg az anti-T65 immuno-toxin rögzítését ezeken a sejteken. ' 0 Ezeknek az immuno-toxinoknak alapvető tulajdonságát, vagyis a cél-sejtekben a fehérje-szintézis gátlást olyan módon mérhetjük, hogy megvizsgáljuk a vizsgált anyagok hatását a 14C-leucin beépü- . lésére rákos sejtekbe, megfelelő tenyészetben. Ezt a mérést a Journal of Biological Chemistry 1974, 249, 3557-62 irodalmi helyen leírt technikából adaptált technika szerint hajtjuk végre, l4C- leucin jelzőanyagot használva a fehérje-szintézis 2C sebességének meghatározására. A beépült radioaktivitás meghatározását a szűréssel kinyert teljes sejten végezzük. Ezekből a meghatározásokból a dózis/hatás görbéit meg lehet rajzolni, az X tengely mutatja a tanulmányozott anyag A-láncának moláris kon- ° centrációját, és az Y tengely a 14C-leucin beépülését, a fehérje-szintézisre ható bármely anyag távollétében vizsgált kontroli-sejteknél mért beépülés százalékában kifejezve. Ilyen módon minden tanulmányozott anyagnál 3C meghatározzuk azt a koncentrációt, amely 50%ban gátolja a I4C leucin beépülését, vagyis az „Inhibitor koncentráció 50”-et (IC 50). Ennek a kísérletnek a különböző vizsgálatait a következőkben mutatjuk be. A megfelelő kísérleti 3& eredményeket az 1. ábra ábrázolja. a) CEM sejteket (ATCC CCL 119) inkubálunk 45 18 órán át 37 °C hőmérsékleten ismert koncentrációjú, referencia-anyagként szolgáló ricin vagy ennek izolált A lánca jelenlétében, majd a radioaktív jelzőanyagot beépítjük a sejtbe. A nyert IC 50 érték 4- 10~ i: mól/1 ricinre és 4,5 ■ 10 Smól/I A-láncra. Azt találtuk, hogy ezek az értékek megkülönböztethetetlenek azoktól az értékektől, amelyet TNP- hapténnel jelzett CEM-sejtekkel nyerünk (1. görbe: ricin CEM sejten; 2. görbe: ricin A-lánc CEM sejten). b) TNP-vel jelzett CEM-sejteket 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk anti-DNP-re fajlagos immuno-toxin jelenlétében (amelyet a korábbi 5C 78 27 838 számú bejelentésben és annak 79 24 655 számú kiegészítésében leírtak szerint nyerünk); majd radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert citotoxicitási görbe alakja és az IC 50 érték (1,5 • 10-9 mól/1), azt mutatja, hogy ezek a sejtek normálisan érzékenyek az anti-DNP immunotoxin hatására, ezáltal bebizonyosodik, hogy ezek a sejtek TNP-vel jól jelzettek. (3. görbe). c) TNP-vel jelzcu CEM-sejteket először 1 óra hosszat inkubálur.V 4 °C hőmérsékleten, 5 egység/ 60 ml nem-konjugált ureáz jelenlétében, majd mossuk, 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk anti- T65 immuno-toxin és 5 mól/l-es karbamid jelenlétében, végül a radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert IC érték 5 • 10“1' mól/1. Ez az 65 55 érték megegyező azzal, amelyet TNP-vel nem jelzett CEM-sejteket használva nyerünk azonos körülmények között, ureázos kezelés nélkül és az inkubáló közegben karbamid nélkül az ureáz mosása után. Ez a vizsgálat mutatja, hogy az inkubálás nem-konjugált ureáz jelenlétében azzal jár, hogy az ureáz nem kötődik a sejthez és ennek eredményeképpen az anti-T65 immuno-toxin hatása nem jut érvényre (4. görbe). d) TNP-vel jelzett CEM-sejteket először 1 óra hosszat 4 °C hőmérsékleten inkubálunk a fentebb leírt immuno-enzim konjugátum jelenlétében, amelyet 6,5 egység/ml koncentrációban alkalmazunk. Azt találjuk, hogy ennek a konjugátumnak, amikor ilyen körülmények közt használjuk, nincs eredendő citotoxicitása az alkalmazott sejtekre. Ezeket a sejteket azután mossuk, hogy eltávolítsunk minden konjugátumot, amely nincs rögzítve, majd 37 °C hőmérsékleten 18 órán át inkubáljuk anti-T65 immuno-toxin és 5 mól/1 karbamid jelenlétében. Végül radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki, az így nyert IC 50 érték 3,5 • 10 n mól/1 (5. görbe). Ez az eredmény azt mutatja, hogy az immuno.enzim konjugátum érvényre juttató hatása mintegy 14 000-szeresére növeli az immuno-toxin citotoxikus hatását a cél-sejtekre. Ez a vizsgálat bizonyítja be, hogy ez az érvényre juttató hatás magába foglalja az immuno-enzim konjugátum rögzítését az immunológiai fajlagosságának megfelelő antigénen. Az említett rögzítés elviseli a sejtek mosását és átengedi a felületét bizonyos enzimatikusan aktív ureázoknak, amelyek az immuno-toxinokkal együtt jelenlevő inkubációs tápközegben található karbamidból NH4+ ionokat termelnek, ezáltal pedig előidézik az NH4+ ionok jól ismert érvényre juttató hatását. Az így nyert érvényre juttató hatás egészen hasonló ahhoz, amelyet korábban figyeltek meg, amikor ammónium-kloridot adtak az inkubációs tápközeghez. Az ammónium-klorid mesterséges adagolása esetében az említett érvényre juttatási hatás nem alakult ki sem ricinnek, sem a ricift A láncával, sem a tanulmányozott sejtekre nem fajlagos immunotoxinnal. Ezeknek a kísérleteknek a körülményei között az anti-T65 immüno-toxin citotoxikus aktivitása az alkalmazott immuno-enzim konjugátum jelenlétében kb. 130 000-szerese a ricin A lánc aktivitásának és az még mintegy 11-szeresen erősebb, mint a ricin citotoxikus aktivitása. 3. példa Maleimid-csoporttal szubsztituált anti-DNP antitest és növényi eredetű ureáz reakciójával nyert immuno-enzim konjugátum. a) Anti-DNP antitest Ez az antitest monoklonális antitest, amelyet hagyományos technikával tisztítottunk Balb/C törzsbeli egerek - amelyekbe F9 hibridómát ültettünk be - hasi vízkóros folyadékjából. Magát az említett hibridómát bovin-gammaglobulinnal - amelyen előzőleg 20 DNP gyököt rögzítettünk mólonként -immunizált Balb/C törzs6
