189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
1 189 246 2 beli egerek lépsejtjeinek és egér NSI mielóma állomány sejtjeinek fúziójával nyerjük. A hibridómát klónozással izoláljuk, hagyományos technikát alkalmazva. Az így nyert antitest G osztályhoz tartozó immuno-globulin, amely a 2 b izotipushoz tartozik, és amelynek affinításí konstansa (e-DNP-lizin ligandumhoz mérve) 1,8 • 10s (mól/))'1. b) Aktivált anti-DNP antitest 2,5 ml anti-DNP antitest oldathoz (9,7 mg/ml 125 mmól/l-es, pH 7-es foszfát-pufferben) 10 1 dimetil-formamidot adunk, amely 0,4 mg m-maleimido-benzoesav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert tartalmaz. A keveréket fél órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az oldatot ez után 10 ml-es Sephadex G 25 oszlopra helyezzük, amelyet előzőleg 125 mmól/l-es (pH 7,0) foszfát-pufferrel egyensúlyoztunk ki. A leoldást a 280 nm hullámhossznál mért optikai sűrűséggel ellenőrizzük. 2,5 ml-t nyerünk vissza az oszlop kiszorítási térfogatából. A szubsztitúciós hányadot egy alikvoton mérjük, feleslegben alkalmazott 14C ciszteinnel végzett reakcióval. így olyan oldatot nyerünk, amely 8 mg antitestet tartalmaz milliliterenként, és egy antitest-molekula 3,5 maleimid-csoporttal van szubsztituálva. c) Ureáz Az alkalmazott enzim a SIGMA-tól származik (VII. típus, U 0376 referencia-szám), aktivitását 170 egység/mg-nak mértük. Egy egység az enzimnek az a mennyisége, amely karbamidból 1 mikromól NH4+ iont szabadít fel percenként 20 °C hőmérsékleten, pH 7-nél. Ennek az enzimnek természetes formájában 27 tiol-csoportja van molekulánként, 480 000 molekulasúlynál. Az említett tiol-csoportok, amelyek ELLMAN módszere szerint mérhetők, nem mind szükségesek az enzim-aktivitáshoz. Ezek közül tehát néhány felhasználható az összekapcsoláshoz az aktivált antitesttel. d) Az antitest összekapcsolása az enzimmel Közvetlenül az után, hogy a sót a G 25 oszlopon eltávolítottuk, 2,4 ml aktivált antitest-oldatot öszszekeverünk 2,0 ml ureáz-oldattal (24 mg/ml koncentrációjú, 125 millimól/ml-es, pH 7-es pufferben). A keveréket 1 órán át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten és centrifugálás után 450 ml-es, PBS pufferrel kiegyensúlyozott Sephadex G 200 géloszlop tetejére helyezzük. A leoldást a 280 nm hullámhossznál mért optikai sűrűséggel és az ureáz-aktivitás SUMMER-technikával történő mérésével ellenőrizzük. A legerősebb ureáz-aktivitást mutató frakciókat egyesítjük és így 14 ml, 102 egység/ml koncentrációjú konjugát-oldatot nyerünk. Ha ennek az oldatnak egy alikvot részét A-fehérje-Sepharose oszlopon kromatografáljuk, azt találjuk, hogy az ureáz-aktivitás 30%-a nem marad az oszlopon. Az ureáz-aktivitás többi része az antitesttel együtt oldódik le pH 3,5-ös pufferrel. Egy kontroli-kísérlet azt mutatja, hogy az antitesttel nem kapcsolódott ureáz kétségtelenül nem rögződik az oszlopon. Ez azt bizonyítja, hogy az egyesített frakciók ureáz-aktivitásának 70%-a valóban az anlitest-ureáz konjugátumhoz tartozik, Az ez után leírt vizsgálatokhoz a szennyező szabad ureázt nem távolijuk el az oldatból, ez az ureáz ugyanis hatástalan az alkalmazott körülmények között, ahogyan ezt később leírjuk. 4. Példa Az anti-T65 immuno-toxin hatásának érvényre juttatása a 3. példa immuno.enzim konjugátjával. A találmány szerinti, a 3. példa alapján nyert konjugátumot biológiai tulajdonságaira és még inkább az anti-T65 immuno-toxin aktivitást érvényre juttató kapacitásra vizsgáljuk egy megfelelő sejtmodellen. Az emlitett modellt humán limfoblasztoid CEM sejt-állományból alakítjuk ki, amely természetes formájában T65 antigént hordoz. Az említett antigén, amely ellen irányul az alkalmazott immunotoxin, alkotja a modell első cél-antigénjeit. Lehetséges ezeket a sejteket trinitrofenil-hapténnel (TNP) jelezni, a 78 27 838 számú korábbi bejelentésben leírtak szerint. Az említett haptént a vizsgált immuno-enzim konjugátumban levő anti-DNP antitest tökéletesen felismeri, és ilyen módon megalkotja a modell második cél-antigénjét. Bebizonyosodott, hogy a sejtek jelzése TNP hapténnel nem változtatja meg a sejtek életképességét és az anti-T65 immuno-toxin rögzítését ezeken a sejteken. Ezeknek az immuno-toxinoknak az alapvető tulajdonságát, vagyis a cél-sejtekben a fehérje-szintézis gátlást, olyan módon mérhetjük, hogy megvizsgáljuk a vizsgált anyagok hatását a 14C-leucin beépülésére rákos sejtekbe, megfelelő tenyészetben. Ezt a mérést a Journal of Biological Chemistry 1974, 249, 3557-62 irodalmi helyen leírt technikából adaptált technika szerint hajtjuk végre, ,4C- leucin jelzőanyagot használva a fehérje-szintézis sebességének meghatározására. A beépült radioaktivitás meghatározását a szűréssel kinyert teljes sejten végezzük. Ezekből â meghatározásokból a dózis/hatás görbét meg lehet rajzolni, az X tengely mutatja a tanulmányozott anyag' A-láncának moláris koncentrációját és az Y tengely a 14C leucin beépülését, a fehérje-szintézisre ható bármely anyag távollétében vizsgált kontroll.sejteknél mért beépülés százalékában kifejezve. Ilyen módon minden tanulmányozott anyagnál meghatározzuk azt a koncentrációt, amely 50"„ban gátolja a 14C leucin beépülését, vagyis az „Inhibitor koncentráció 50”-et (IC 50). Ennek a kísérletnek a különböző vizsgálatait a következőkben mutatjuk be. A megfelelő kísérleti eredményeket a 2. ábra ábrázolja. a) Ezt az ellenőrző vizsgálatot a 2. példa a) vizsgálatának megismétlésével végezhetjük el, ez a vizsgálat ugyanis itt is érvényesnek tekinthető. b) TNP-vel jelzett CEM-sejteket inkubálunk 18 órán át 37 °C hőmérsékleten anti-T65 fajlagosságú immuno-toxin jelenlétében (ezt az immüno-toxint a bejelentőnek egy korábbi, 81 21 836 számú bejelentése szerint készítjük), majd a radioaktív jelzőanyag beépítésének tesszük ki. A nyert citotoxicitási görbe azonos azzal, amelyet ugyanolyan, de TNP-vel nem jelzett sejttel nyerünk azonos inkubálási körülmények közt; ezzel lehet bebizonyítani. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
