189127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az arginin-vazopresszin antidiuretikus és/vagy vazopresszor hatását antagonizáló új oktapeptidszármazékok előállítására

1

.189.127

2

C. etanol (95%-os)-ammónia (34%) = 3:1;

D. kloroform-metanol = 7 :3;

E. 1-butanol-ecetsav-víz = 4:1:5, felső fázis;

F. 1-butanol-ecetsav-víz-piridin = 15 : 3 : 3 : 10.

A lemezekre 10-50 pg-nyi mintákat vittünk fel. A kromatogrammokat legalább 10 cm magasságig futtattuk. A kromatogrammok előhívására kloroplatinát-reagenst és jódgőzöket használtunk:

A peptidek aminosav-analízisét Spackman és munkatársai [Anal. Chem., 30(1958), 1190] módszerével végeztük, amely szerint légritkított ampullákba bemértünk körülbelül 0,5 mg peptidet és állandó forrpontú sósavat (400 pl), majd az ampullákat leforrasztottuk és 18 órán át 120 °C hőmérsékleten tartottuk. Az analízist egy Beckman-féle automatikus aminosav-analizátorral (Model 121) végeztük. Az aminosavak arányát a glicinre vonatkoztatva adjuk meg (Gly= 1,00). Az elemi analíziseket a Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, Tenn, végezte. A megadott elemekre nézve a talált értékek ±0,4%-os határon belül megegyeztek az elméletileg számított értékekkel. Az optikai forgatóképességet egy Bellingham Stanley, Ltd., Model A polariméterrel (pl-típus) határoztuk meg.

1. példa

ß - (S- Benzilmerkap to jß, ß-c/7: lopen tame tilén - propionil~Tyr( Me)-Phe-Gln-Asn-Cys( Bzl)-Pro- Arg( Tos ) -Gly-NH2

A) módszer

A szilárd fázisú szintézis és az oldatban kivitelezett szintézis kombinációja

319 mg (0,26 mmól), Bankowski és munkatársai módszerével [J. Med. Chem., 21 (1976), 842] előállított Boc-T yr-(Me)-Phe-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-t feloldunk 6,5 ml trietil-aminban, és az oldatot 40 percig szobahőmérsékleten keverjük. Utána hozzáadunk 20 ml lehűtött dietilétert, és a szilárd csapadékot kiszűrjük és ötször 10 ml dietil-éterrel mossuk. A terméket nátriumhidroxid fölött, csökkentett nyomáson szárítjuk. Az így kapott terméket (súlya: 318,5 mg) feloldjuk 0,8 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz hozzáadunk 10 pl N-metil-morfolint. Megnedvesített pH-papíron mérve az oldat pH-ja: 7-8. Ezt a semlegesített oldatot szobahőmérsékleten félórán át keverjük, majd hozzáadjuk 445 mg (1,155 mmól), Nestor és munkatársai módszerével [J. Med. Chem., 18 (1975), 284] előállított ß-(S-benzilmerkapto)-ß,ß-ciklopentametil0n-propionsav-pnitro-fenil-észter 0,4 ml dimetil-formamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ekkor a D-jelű futtató elegygyel végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat azt mutatja, hogy a reakcióelegyben nyomokban még jelen van a szabad oktapeptid-amid. Ekkor az elegyhez hozzáadunk 39,3 mg (0,26 mmól), König és munkatársai módszerével [Chem. Bér., 103 (1970), 788] előállított N-hidroxi-benzotriazolmonohidrátot. A kapcsolási reakció 5 óra alatt teljesen lejátszódik. Az elegyből kivált csapadékot

kiszűrjük, négyszer 10 ml lehűtött etil-acetáttal mossuk és csökkentett nyomáson megszárítjuk. A kapott nyersterméket (súlya: 330 mg) dimetilformamid és metanol elegyéből kétszer átcsapjuk, és így 295,2 mg (hozam: 77,3%) acilpeptid-amidot kapunk, op.: 209-211 °C;

[a]p = -43,6° (c = 0,5, dimetil-formamid); R,(E) = 0,45; R,(F) = 0,63.

\minosav-analízis: Tyr: 0,80; Phe: 1,01; Glu: 1,04; Asp: 1,02; Cys(Bzl): 0,98; Pro: 1,06, Arg: 1,01; Gly: 1,00; NH3: 2,91.

B) módszer

Gyantán végrehajtott totálszintézis

1,11 g (0,4 mmól), a szilárd fázisú szintézis módszerével gyantához kötött Boc-Gly-böl kiindulva előállított, gyantához kötött Boc-Tyr(Me)-Phe- Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-ből kiindulva, és arról a védőcsoportot lehasítva, a terméket semlegesítve, majd ß-(S-benzilmerkapto)-ß,ß-ciklopentametilén-propionsav-p-nitro-fenil-észterrel (lásd Nestor és munkatársai fent idézett müvét) kapcsolva állítjuk elő a gyantához kötött acil-oktapeptidet (súlya: 1,167 g, súlynövekedés: 57 mg, az elméleti súlynövekedés 97,6%-a). Ezután a gyantát ammonolízisnek vetjük alá [Manning, J. Am. Chem. Soc., 90 (1968), 1348]. A terméket dimetilformamiddal kivonatoljuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot víz hozzáadásával kicsapjuk. A 410 mg súlyú nyersterméket dimetil-formamid és etanol elegyéből kétszer átcsapjuk, ily módon 302 mg (hozam: a gyantához kötött kiindulási glicinre számítva: 50,7%) aciloktapeptidet kapunk, op.: 206-208 °C (bomlik); R,<E) = 0,45, R,(F) = 0,63;

[a]p = -43,1° (c=l, dimetil-formamid). Aminosav-analízis: Tyr: 0,79; Phe: 1,01; Glu: 1,03; Asp: 1,04; Cys(Bzl): 0,97; Pro: 1,03; Arg: 0,99; Gly: 1,00; NH3: 2,95.

2. példa

ß- ( S- Benzilmerkapto ) - ß,ß-cik lopen tarnet ilénpropionil- T vr( Bzlj-Phe-GIn-Asn-C ys( Bzl )-Pro- Arg( Tos) -Gly-NH2 '

1,46 g (0,5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-Phe-Gln-Asn- Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)Gly-t az 1. példában leírt módon, a védőcsoport lehasítása, semlegesítés és ß-(S-benzilmerkapto)-ß,ß-ciklopentametitenpropionsav-p-nitro-fenil-észterrel kapcsolva gyantához kötött acil-oktapeptiddé alakítunk. (Súlya: 1,55 g, súlynövekedés: 70 mg, az elméleti súlynövekedés 95,9%-a). A gyanta ammonolizise útján kapott terméket dimetil-formamiddal kivonatoljuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot víz hozzáadásával kicsapjuk. A 723 mg súlyú nyersterméket dimetil-formamid és etanol elegyével, majd dimetil-formamid és 2%-os, vizes ecetsav elegyével átcsapjuk. Ily módon 488 mg cím szerinti terméket kapunk, hozam a gyantához kötött glicin mennyiségére számítva:

5

10

15

20

25

30

'35

40

45

50

55

60

65

7