188911. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált vinil-karbonsav-származékok előállítására
1 188 911 2 1. Hatástani vizsgálat A tromboxán A2 (XA2) szintézisét katalizáló enzimekre kifejtett gátló hatás vizsgálata Neodelman és munkatársai [Science 193, 163 (1976)] módszere szerint a tromboxán szintézisét katalizáló enzimként indometacinnal kezelt, lóvérből származó trombocita-mikroszómákat (a továbbiakban ennek jelölése: 1PM) alkalmaztunk. 60 pl lPM-et (fehérjeként 140 pg) tartalmazó TRIS-pufferoldathoz (pH 7,5) 60 pl olyan oldatot adunk, amely a vizsgálandó vegyületeket különböző koncentrációban tartalmazta. Az így kapott keveréket 5 percig állni hagytuk, majd jéghűtés közben 20 pl olyan pufferoldatot adtunk hozzá, mely 30 mg prosztaglandin H2-t tartalmazott. Az így kapott elegyet 5 percig 0 °C-on hagytuk állni a tromboxán A2 képződése végett, majd 500 pl TRIS-pufferoldatta! a reakciót leállítottuk. Az így nyert elegyből 50 pl-t kivettünk, és a tromboxán A2-t, amely a tromboxán A2 stabilis metabolitja, radioimmunmeghatározás segítségével kvantitatíve megmértük [Shibouta és munkatársai, Biochem. Pharmacol. 28, 3601 (1979)]. A vizsgálandó vegyületnek a tromboxán A2 szintézisét katalizáló enzimre kifejtett gátló hatását a vizsgálandó anyagot tartalmazó és a kontrolloldatban képződő tromboxán B2 különbségéből állapítottuk meg. Vizsgálati eredményeinket az alábbi 7. táblázatban foglaltuk össze. 7. táblázat A tromboxán A2 szintézisét katalizáló enzimekre kifejtett gátló hatás A vegyület jele A tromboxán A2 szintézisét katalizáló enzimre kifejtett százalékos gátló hatás 3X10"8 M koncentrációban 10-7 M koncentrációban la-4 58,5 92,8 la—6 64,3 98,6 la—8 55,7 93,3 la-10 36,2 90,4 lb-13 78,5 95,7 Ib-16 49,1 89,0 lb-20 82,5 96,6 Ib-21 50,1 94,1 lb-22 75,8 98,3 Ib-30 30,6 84,6 lg—66 19,4 65,9 li-75 56,2 92,3 2. Hatástani vizsgálat A prosztaglandin H2 vagy prosztaglandin G2 serkentő hatása az érfalban képződő prostaglandin 12 bioszintézisére A trombocita-aggragációs kísérletet Bron [Nature 194, 927 (1962)] módszerével végeztük. 250 pl trombocitákban dús, szokásos módon készített nyúl plazmát 25 pl 7,5 pH értékű 50 mmólos TRIS- pufferoldathoz adtunk, mely meghatározott koncentrációban tartalmazta a vizsgálandó vegyületet. Az elegyet két percig keverjük, majd 1 mg súlyú olyan patkány-aortacsíkot adtunk hozzá, amely prosztaglandin I2 t szintetizáló enzimet tartalmazott. Két perc múlva 25 pl 0,21 mmólos arachidonsav-oldatot adtunk hozzá a trombocita-aggregációs készség megállapítása végett. Az arachidonsav hozzáadása után 6 perccel a mintaoldatból 20 pl-t kivettünk és a tromboxán B2-t, amely a tromboxán A2 stabilis metabolitja, valamint a 6-keto-piosztaglandin F^-t, amely a prosztaglandin I2 stabilis metabolitja, radioimmunmaghatározással mértük [Shibouta és munkatársai, Biochem. Pharmacol. 28, 3601 (1979); Terashita és munkatársai, Japan J. Pharmacol., 32, 351 (1982)]. összehasonlítottuk a patkányaortacsíkol tartalmazó oldatok trombocita-aggragációs készségét, illetve tromboxán B2 és 6-keto-prosztaglandin F,a mennyiségét a patkányaortacsíkot nem tartalmazó oldatokéval. A 8. táblázatban azon esetekben, ha aortacsíkot nem adtunk az oldathoz, a vér trombocita-aggragációs képessége a 0,21 mmólos arachidonsav-oldat következtében 100 %-volt, ezzel egyidőben 32 ng tromboxán B2 képződött, és 6-keto-prosztaglandin F,a képződését nem figyeltük meg. Ha 10-6 mól 7-fenil-7-(3-piridil)-6-hepténsavat [(la- 4) képletű vegy ölet] adtunk az oldathoz, akkor az aggregációs készség enyhén, 93 %-ra csökkent. Ebben az esetben a tromboxán B2 képződése csaknem teljesen megszűnt (2 ng-ra csökkent). Ha az aortacsíkot hozzáadtuk, akkor az aggregációs viszony 70 %-ra, a tromboxán B2 mennyisége pedig 32 ng-ról 27 ng-ra csökkent, viszont a 6-keto-prosztaglandin F^ mennyisége 0-ról 22 ng-ra növekedett. Szemben ezzel, ha az aortacsík és 1Û'6 mól (Ia-4) képletű vegyület együttesen fejtették ki hatásukat, akkor az aggregációs viszony tovább csökkent 31 %-ra, a 6-keto-prosztaglandin F,a mennyisége pedig jelentős mértékben 22 ng-ról 38 ng-ra növekedett. Ezeknek az eredményeknek az alapján úgy tekinthetjük, hogy az (la-4) képletű vegyület képes a tromboxán A2-nek arachidonsavból a trombocitában végbemenő bioszintézisénck teljes gátlására, és abban az esetben, ha aortacsík is jelen van, meggyorsítja a prosztaglrndin H2 és prosztaglandin G2 — azaz a tromboxán A; prekurzorainak — érfalban végbemenő prosztaglandin 12 biosztintézis céljára való hasznosulását. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 18
