188861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új lipofil muranil- peptidek előállítására
1 188 86! 2 A következő példák a találmány szerinti eljárás bemutatására szolgálnak, de a találmány köre nem korlátozódik a példákban leírtakra. A hőmérsékletet Celsius-fokokban adjuk meg. Az (I) általános képletnek megfelelő vegyüíetek nem jellemezhetők olvadáspontjukkal, de spektroszkópiai adatok, így NMR- és IR-spektrumok sem alkalmasak a pontos jellemzésre. A finomjellemzéshez nem megfelelő az Rf-értékek megadása sem, a lipidrészek domináló természete miatt. Mivel azonban a kiindulási anyagok szerkezete pontosan ismert (1. 25 55 500 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat; a mindenkor alkalmazott foszfolipidkomponens kereskedelmi termék) és mivel a foszfolipid és a muramil-peptid kapcsolódása egyértelmű, ezáltal a végtermékben az építőelemek szekvenciája és a végtermék szerkezete is egyértelműen rögzített. Az (I) általános képletű vegyületekben az oxigénatomon keresztül a foszforhoz kapcsolódó proton bázisokkal könnyen lehasítható. Az (I) általános képletű vegyüíetek rendszerint a szabad vegyüíetek és sóik elegyeként vannak jelen. így a következő 1-12. példában leírt (I) általános képletű muramilpeptidek körülbelül 40 — 55 %-ban sóként vannak jelen. Ezek a sók ugyancsak a találmány körébe tartoznak. 1. példa 1,4 mmól 1,2 - dipalmitoil - sn - glicero - 3 - foszforil - etanol - amin és 2,5 mmól trietil-amin 25 m! 65 :25 ; 4 arányú kloroform - metanol - víz eleggyel készített oldatához hozzácsepegtetjük 2 mmól N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutamin - N - hidroxi - szukcinimidészter 6,5 ml dimetilacetamiddal készített oldatát. Az oldatot 18 óra hosszat 20 °C-on keverjük és utána csökkentett nyomáson körülbelül 15 ml-re betöményitjük, eközben emulzió képződik. Ezt az emulziót 200 ml vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk. A maradékot 30 ml vízben szuszpendáljuk és vízzel szemben extenzíven dializáljuk. A belső dializátumot, amely a kívánt terméket tartalmazza, fagyasztva szárítjuk. Az N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutaminjl - 2 - (l’,2’ - dipalmitoil - sn - glicero - 3’ - foszforil) - etil - amidot kromatográfiás úton egy Sephadex LH-20 oszlopon tisztítjuk. Az eluálást 25 : 15 : 4 : 2 arányú kloroform - metanol - ecetsav - víz - eleggyel végezzük. A vegyidet vékonyrétegkromatográfiában szilikagélen a következő Rfértékeket mutatja: 0,31 (kloroform - metanol - víz, 65 : 25 : 4), illetve 0,64 (kloroform - metanol - ecetsav - víz, 25 : 15 :4 : 2). Az új vegyületet analitikailag azzal jellemezzük, hogy az építőelemeket, így az N - acetil - muraminsavat, palmitinsavat, foszfátot, L-alanint és a D- glutaminsavat, mennyiségileg meghatározzuk; az N - acetil - muraminsavat a Morgan - Elsőn reakció J. M. Ghuysen és mtsai. által módosított változata segítségével spektroszkópiás úton [„Methods in Enzymology” 8, 629 (1966)]. A foszfátot Lowry és munkatársai szerint menynyiségileg meghatározzuk [J. Biol. Chem. 207, 1 (1954)]. A palmitinsavat és az aminosavakat teljes hidrolizátumban (6 n HC1, 24 óra 110 °C) gázkromatográfiásán, illetve aminosavanalizátor segítségével pentadekánsav illetve Norleucia mint belső szabvány alkalmazása mellett mennyiségileg meghatározzuk. A talált moláris viszonyok a foszfátra vonatkoztatva a következők: P04”’: N - acetil - muraminsav : L - alanin : D - glutaminsav : palmitinsav- l : 0,92 : 0,91 : 0,95 : 2,18. Az N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutamin - N - hidroxi - szukcinimid - észtert, amelyet kiindulási anyagként alkalmazunk, például a következő módon állítjuk elő: 2 mmól N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutamint, 2,2 mmól N - hidroxi - szukcinimidet és 2,2 mmól diciklohexil - karbodiímidet 6,5 ml dimetil - acetamidban oldunk és az oldatot 18 óra hosszat 20 °C-on keverjük. A kivált diciklohexil - karbamidot elkülönítjük és az oldatot közvetlenül felhasználjuk a foszfolipiddel való kondenzálásh02. Az 1,2 - dipalmitoil - sn - glicero - 3 - foszforil - etanol - amin, amelyet kiindulási anyagként alkalmazunk, egy kereskedelmi forgalomban levő szintetikus készítmény. 2. példa Az 1. példában leírt módszerhez hasonló módon állítunk elő N - acetil - demetil - muramii - L - alanil - D - izoglutaminil - 2 - (l’,2’ - dipalmitoil - sn - glicero - 3’ - foszforil) - etil - amint 1,2 - dipalmitoil -,sn - glicero - 3 - foszforil - etanol - aminból és N - acet;l - demetil - muramii - L - alanil - D - izoglutamin - N - hidroxi - szukcinimid - észterből kiindulva. Az Rf értékek szilikagélen a következők: 0,29 (kloroform - metanol - víz, 65 : 25 : 4), illetve 0,65 (kloroform - metanol - eceísav - víz, 25 : 15 : 4 : 2) Analízis: L - alanin : D - glutaminsav : palmitinsav= 1 : 0,94 : 2,09. 3. példa. Az 1. példában leírtakhoz hasonló módon kapunk N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutaminil - y - oxi - metil - karbonil - 2 - (l\2* - dipalmitoil - sn - glicero - 3’ - foszforil) - etil - amidot 1,2 - dipalmitoil - sn - glicero - 3 - foszforil - etanol - aminból és N - acetil - muramii - L - alanil - D - izogiulamin - y - karboximetiiészter - N - hidroxi - szukcinimid - észterből kiindulva. IR (KBr): 3400, (O, NH), 2920, 2855; 1745 (C = 0), 1665 (C = 0), 1550 (C = 0), 1470, 1380, 1240 (P = 0), 1170, 1100, 1065, 720 cm'1. A vegyület vékonyrétegkromatogramban szili-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
