188752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin C-terminális hexapeptid előállítására
1 18 782 2 A találmány tárgya új eljárás az (1) kcpletü hexapeptid előállítására L-Mct-Gly-L-Trp-E-Mel-E-Asp-L-Phc-Nh, (I) A fenti hcxapcptid a kolccisztokinin oktapeptid különböző előállításmódjainak fontos intermedierje és jó termeléssel, nagy tisztaságban történő előállítása a mind elméleti, mind klinikai szempontból jelentős kolecisztokinin oktapeptid-szintéziseinek egyik kulcsfontosságú lépése. A fenti (I) kcpletü hcxapcptid előállítása több cikkből és szabadalomból is ismert (3 488 726 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom; J. Am. Chem. Soc. 92, 195- 197 (1970)], azonban a peptid számos rendkívül érzékeny aminosavmaradékot tartalmaz, így két metionint, triptofánt, aszparaginsavat és így tisztán jó termeléssel történő előállítása az eddig ismert eljárásokkal nem volt lehetséges. A peptid szintézisére felhasználható védőcsoporlok száma meglehetősen korlátozott, reduktív védőcsoporteltávolítás (pl. benziloxi-karbonil-csoport) a molekula összetétele miatt nem jöhet szóba. Részben a két melionin-maradék mint katalizátor méreg szerepel, másrészt a triplofân índol-gyürüjénck telítődése is gátat szab ennek a lehetőségnek. Savas védöcsoport-cltávolítás is számos mellékreakciót okoz (a triptofán és a metionin bomlik, terc-butileződés, oxidáció történhet). Bázisérzékeny védőcsoport (9-fluorenil-metil-oxi-karbonil) felhasználása az igen magas ár miatt nem kedvező. A savas védöcsoport-cltávolítás látszik a legcélszerűbbnek, azonban az ennek során fellépő mellckrcakciók erősen csökkentik a hozamot. Az ismert módszerekkel a tisztítatlan terméket is csak 50 % körüli bruttó hozammal lehet előállítani. További hátrányt jelent, hogy ismert módszerekkel kapott termék - a triptofán- és metionin-részek részleges bomlása miatt - vékonyrétegkromaiográfiásan nem egységes, és a szennyező melléktermékeket csak bonyolult, többlépéses oszlopkromatográfiás módszerekkel lehet a kívánt hexapeptidből eltávolítani. A tisztítási műveletek vegyszer- és munkaigényesek, költségesek, és tovább csökkentik az elérhető hozamot. Célul tűztük ki, hogy olyan technológiát dolgozzunk ki, melynek segítségével a felsorolt hátrányok kiküszöbölhetők. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a legalkalmasabb kiindulási megoldás a savas védöcsoportcltávolítás, amennyiben a zavaró mellékreakciókal ki tudjuk küszöbölni. Ezt a problémát munkánk folyamán egy olyan új acidolitikus reagens használatával tudtuk megoldani, amely gyökfogó vcgyülclckct is tartalmaz. Acidolitikus reagensként a találmány szerint trifluor-ecetsav, víz tioglikolsav és ditiotreitol 50 : 30 : 10 : 10 és 95 : 3 : 1 : 1 közötti súlyarányé keverékeit használjuk. A reagens akkor bizonyult a legkedvezőbbnek, amikor 85 % triíluor-ecelsaval, 10 % vizet, 2 % tioglikolsavat és 3 % diliotreitolt tartalmazott. Ha ezzel az új keverékkel nitrogén-atmoszfrérában hasítjuk le a védőcsoportot, úgy a zavaró mellékreakciókat teljesen kiküszöbölhetjük, és vékonyrétegkromatográfiásan egységes, tiszta terméket kapunk. A mellékreakciók elmaradása miatt nő a termék hozama, és a bonyolult tisztítási műveletek szükségtelenné válnak. Az (I) képletü hexapeptidet a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy az irodalomból ismert [.1. Chcm. Soc. 555-566 (l966)].L-aszpartil-L-lcni!nlaninamidot terc-butil-oxi-karbonil-L-triptrofil-L-metionin-aziddal acilezzük, a kapott letrapeptidről a tercbutil-oxi-karbonil-védőcsoportot 50 : 30 : 10 : 10 és 95 :3 1 : 1 közötti súlyarányú trifluor-ecetsav : víz : - tioglikolsav : ditiotreitol eleggyel eltávolítjuk, majd a kapott terméket terc-butil-oxi-karbonil-L-metionilglicin-(pcntaklór-fcnil)-csztcrrcl rcagállatjuk, és a képződött védeti hcxapcptidről a védőcsoportot ugyancsak a fenti összetételű trifluor-ecetsav : viz : tioglikolsav : ditiotreitol eleggyel hasítjuk le. Az eljárás során az (I) képletü hexapeptid trifluor-ecetsav sója formájában képződik. Kívánt esetben az (I) képletü hexapeptidet bázissal felszabadítjuk a sóból. Erre a célra az (I) kcpletü hcxapcptid sójával ekvivalens mennyiségű szerves bázist, például trietil-amint, N- metil-morfoünt, di-izopropil-etil-amint használhatunk. Ezzel az eljárással vékonyrétegkromatográfiásan egységes, nagy tisztaságú terméket kapunk, amely minden további tisztítás nélkül alkalmas a biológiailag jelentős kolccisztokinin felépítéséhez. Eljárásunk részleteit az alábbi példán mutatjuk be, ahol a vékonyrétegkromntográflás vizsgálatokhoz a következő összetételű oldószer-elegyeket használtuk: 1. 85 ml etil-acctát : 15 ml (75 : 10 : 24 térfogatarányú n-buto!-ecetsav-víz elegy) 2. 70 ml etil-acctát : 30 ml (75 : 10 : 24 térfogalarányú n-butol-ecetsav-víz elegy) 3. 50 ml etil-acetát : 50 ml (20 : 6 : 11 térfogatarányú piridin-ecetsav-víz elegy) Példa 0,9 g (2 mmól) tcrc-buti!-oxi-karbonil-L-triptoli!-L- metionin-metil-észtcr 3 ml metanolban oldunk, majd 0,5 ml (10 mmól) hidrazin-hidrátot adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten egy napig állni hagyjuk, majd a terméket 30 ml éter és 15 ml n-hexán clcgyévcl kicsapjuk. A kapott kristályokat szűrjük, hexánnal mossuk. 0,76 g (84 %) tcrc-butil-oxi-karbonil-L-lriptofil-L-metionil-hidrazidot kapunk; op.: 127 °C, R/=0,8. 14,85 g (33 mmól) terc-butil-oxi-karbonil-L-triptolil-L-metionil-hidrazidot 120 ml abszolút dimetilformamidban oldunk, majd az oldatot -30 °C-ra hütjük, és 6,6 ml 5 mólos vizes nátrium-nitrit oldatot és 6,6 ml 10 N vizes sósav-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet 30 percig keverjük, ezután 9,2 g (33 mmól) l-aszpartil-L-fenilalanin-amidot adunk hozzá, és a pH-t trietil-aminnal 7,5-re állítjuk. Két napos reakció után a reakcióelegyet 30 ml végtérfogatra bepároljuk, és a lerméket 0,01 n vizes sosav-oldatlal kicsapjuk a konccntrátumból. A kivált terméket szűrjük, és vízzel, 1 : 1 arányú vizes acetonnal, végül éterrel mossuk. 15,5 g (67 %) terc-buti!-oxi-karbonil-L- triptofil-L-metionil-L-aszpartil-L-fenilalanin-amidot kapunk; R* = 0,38. ! I g terc-bulil-oxi-karbonil-L-triptofil-L-metionil- L-aszpartil-E-fcnilalanin-amidol ) °C-on 36 ml Iriflu-F, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 2
