188729. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kötődés sztereoszelektivitásának megnövelésére
1 188 "29 2 A találmány tárgya: eljárás benzodiazepinek kötődése sztereoszelektivitásának megnövelésére, melynek segítségével kírális benzodiazepinek racemátjaí kromatográfiás úton vagy ultraszűréssel, vagy dialízissel, vagy centrifugálással rezolválhatók (sztereoizomerekre szétválaszthatok). Mint ismeretes, az élő szervezetet felépítő kírális (tükörképi aszimmetriát mutató) vegyületek (pl, aminosavak, cukrok stb.) optikailag aktívak, tehát a szervezetben a kémiailag lehetséges kétféle sztereoizomer közül csak az egyik fordul elő. Áz életműködéseket meghatározó enzimek, ill. receptorok is jellegzetesen sztereospecifikusak. Ennek következtében a szintetikus úton előállított kiráüs szerkezetű gyógyszerek kétféle sztereoizomerjének hatásában rendszerint igen számottevő, nagyságrendi eltérés mutatkozik. A hatékonyabb sztereoizomer felismerése nagy jelentőségű, mert lehetővé teszi a gyógyszer dózisának csökkentését és a kívánt gyógyító hatás fenntartása mellett a nem kívánatos mellékhatások kiküszöbölését. Számos gyógyszer mégis racém formában kerül forgalomba. Ennek oka az, hogy a kémiai szintézisben keletkezett racemát klasszikus kémiai módszerekkel való rezolválása vagy sztereospecifikus szintézis kidolgozása költséges, nagy anyagveszteséggel jár. A rezolválás különösen nehéz a farmakológiai vizsgálatokhoz szükséges radioaktív preparátumok esetében. Sok esetben a gyógyszer tiszta sztereoizomerek formájában nem is kerül kipróbálásra. Kiráüs adszorbensek, pl. szérumfehérjék felületén bekövetkező sztereoszelektív kötődés lehetőséget ad racemátok kvantitatív rezolválására. Ilyen megoldást ismertetett pl. K. K. Stewart és R. F. Doherty (Resolution of DL-tryptophan by affinity chromatography on bovine serum albumin — agarose columns. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 2880 [1973]), valamint C. Lagercrantz, T. Larsson és Í. Denfors (Stereoselective binding of the enantiomers of warfarin and tryptophan to serum albumin from some different species studied by affinity chromatography on columns of immobilized serum albumin. Comp. Biochem. Physiol. 69C, 375 [1980]). Ezen eljárások hátránya, hogy a kapacitásuk kicsiny és így számottevő mennyiség anyag előállítása céljából az eljárást nagyon sokszor kell ismételni. Ez különösen hátrányos, ha a kötődés szelektivitása kicsi, A találmánnyal az a célunk, hogy az ismertetett hiányosságokat kiküszöböljük. Megoldásunkkal a szérumfehérje és a rezolválandó királis benzodiazepinek közötti kötődés szelektivitását nagymértékben megnöveljük. így lehetővé válik az adszorbens kapacitásának maximális kihasználása, ami az eljárást preparatív célokra is alkalmassá teszi. A találmány alapja az a felismerés, hogy a szérumfehérjék kötőhelyeinek szelektivitását adalékanyag segítségével nagymértékben fokozni lehet. A találmány értelmében a fenti felismerés alapján az ismert megoldások hiányosságait olyan eljárással küszöböljük ki, melynek lényege, hogy a szérumfehérje és a benzodiazepin racemát között molekuláris kapcsolatot létesítünk, majd a sztereoizomerek kötődésének erősségét warfarin adalékanyaggal megváltoztatjuk, a sztereoízomereket egymástól szétválasztjuk és az adalékanyagtól megtisztítjuk. Preparatív célú felhasználás, különösen radioaktív racemát rezolválása esetén célszerű a sztereoízomereket kromatográfiás úton elválasztani. mert ily módon a radioizotópos veszteség a minimálisra csökkenthető. Az ultraszűrés, dialízis, illetve centrifugálás használata akkor előnyös, ha csak az egyik sztereoizomerre van szükségünk. Az eljárás alkalmazását az alábbi példákon mutatjuk be, amelyekre — természetesen — a találmány nem korlátozódik. 1. példa Radioaktív lorazepárn-acelát (7 - klór - 5(2 - klór - fenil) - 1,3 - dihidro - 3 - hidroxi - 2H - 1,4 - benzodiazepin - 2 - on - acetát) racemátjának rezolválásához 1,8 x 26 cm méretű affinitáskromatográfiás oszlopot készítünk. Az oszlop töltete 50 tnl I % immobilizált humán szérum albumint tartalmazó Sepharose 4B. Az oszlopon 50 ml Í0~4 M warfarint (3 - (3 - oxo - 1 - fenil - butil) - 4 - hidroxi - humarint) tartalmazó pH: 7,4 foszfát puffert engedünk át. Az oszlopra feladunk 6 mg radioaktív í/Morazepám-acetátot, a warfarinos pufferrel eluálunk, az eluátumot 10 ml-es frakciókban gyűjtjük és minden frakcióból 0,1 ml-es minta radioaktivitását folyadék-szcintillációs módszerrel határozzuk meg. A feladott radioaktivitás 50 %-a, amely az /sztereoizomerhez tartozik, kb. 100 ml térfogatnál eluálódik. A d-sztereoizomer az oszlopról 100 ml 1 %-os albuminos puffer átengedésével mosható le. Adalékanyag (Warfarin) nélkül az adott körülmények között a két enantiomer csak részlegesen válik szét az oszlopon, ami nem teszi lehetővé tiszta termék előállítását. A két radioaktív mintát tartalmazó eluátumot liofilizáljuk és a radioaktív d- és !lorazepám-acetát sztereoízomereket a maradékból 3 x 30 ml kloroformmal extraháljuk, majd bepároljuk. A warfarintól további, preparatív szilikagél rétegen végzett vékonyréteg-kromatográfiás lépésben választjuk el. Az alkalmazott futtatóelegy őszszetétele: 60 ml benzol, 40 mi dietiléter, 7 ml elánok (Lorazepám-acetátra R); = 0,52, warfarinra Rr = 0,74). A rezolvált radioaktív enantiomerekel 2,0-2,5 mg mennyiségben nyerjük. Az oszlop regenerálás után újból felhasználható. A rezolvált termékeket újra feladva az oszlopra pufferral egy csúcsban eluálódnak. CD-spektrum felvételével igazolható, hogy az először eluálódó anyag /-lorazepám-acetát (As^xnm= - 21,9 M "' cm“'), míg a warfarin jelenlétében csak fehérjével lemosható anyag d-iorazepáin-aceíát (Ae“)xnm= + 21,7 M '1 cm-'). 2. példa 200 ml 10~4 M warfarint és I % marha szérum albumint tartalmazó pH 7,4 foszfát pufferhoz 4 ml etanolban oldott 20 mg (//-lorazepám-acetátot ke-6 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
