188729. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kötődés sztereoszelektivitásának megnövelésére
verünk. Ultraszürő cellában ÀMICON YM-10 membránon leszűrjük. A szűrletet liofilizáljuk, az /-lorazepám-acetátot 3 x 30 ml kloroformmal extraháljuk, majd bepároljuk. A warfarintól preparativ szilikagél rétegen 60 ml benzol, 40 ml dietiléter, 7 ml etanol összetételű oldószer eleggyel vékonyréteg-kromatográfiás úton választjuk el. A termék 5 mg /-lorazepám-acetát. Adalékanyag (warfarin) nélkül a példa szerint eljárva enantiomerek keverékéhez jutunk. A célul kitűzött előnyök elérésén felül eljárásunk azzal az előre nem látható, meglepő előnnyel is jár, hogy lorazepám-acetát rezolválása esetén a sztereoszelektivitás az ismert megoldásokhoz képest több százszorosára növekszik, ami a sztereoizomerek szétválasztását nagy mennyiségek esetén is keresztszennyeződéstől mentessé teszi. 3. példa Radioaktív oxazepám-acetát (7 - klór - 1,3 - dihidro - 3 - hidroxi - 5 - fenil - 24 -1,4 - benzodiazepin - 2 - on - acetát) racemátjának rezolválásához affinitás kromatográfiás oszlopot készítünk (1,4x23 cm). A 40 ml 1 % immobiüzált humán szérumfehérjét tartalmazó Sepharose 4B gélt lO-4 M warfarint tartalmazó pH: 7,4 foszfát pufferrel egyensúlyba hozzuk. Az oszlopra feladunk 6 mg radioaktív t//-oxazepam-acetátot, majd a warfarinos pufferral eluálunk. Az eluátum radioaktivitását folyadékszcintillációs módszerrel mérjük. Az első csúcs (/-sztereoizomer) kb. 80 ml térfogatnál eluálódik. A «/-sztereoizomer ettől jól elkülöníthetően, kb. 220 ml-es csúcsmaximummal hagyja el az oszlopot. A két radioaktív mintát tartalmazó eluátumot liofilizáljuk, és a radioaktív d- és /-oxazepám-acetátot 3 x 30 ml kloroformmal extraháljuk a maradékokból. A kloroformot bepároljuk, az így izolált sztereoizomereket áz inaktív warfarintól preparatív szilikagél rétegen végzett vékonyrétegkromatográfiás módszerrel választjuk el. Az alkalmazott oldószerelegy 50 ml benzol, 50 ml éter és 7 ml etanol elegye. (Oxazepám-acetát ra RF = 0,63, warfarinra R.f = 0,79). A rezol vált radioaktív enantiomereket 2,0-2,5 mg mennyiségben nyerjük. CD-spektrum alapján igazolható a termékek optikai tisztasága. Az először eluálódó anyag /-oxazepám acetát (Ae“nm= —46,3 M_l cm"'), míg a második csúcs í/-oxazepám-acetát (Ae^a5xlim = + 45,9 M”! cm"'). Adalékanyag nélkül eljárva a két sztereoizomer csak részben szeparálódik és ezért rosszabb hozammal is kevésbé tiszta termékhez jutunk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás benzodiazepinek kötődése sztereoszelektivitásának megnövelésére, amikoris szérumfehérje, célszerűen humán szérum albumin és kiráks benzodiazepin racemátok sztereoizomerjei között molekuláris kapcsolatot létesítünk, azzal jellemezve, hogy a sztereoizomerek kötődésének erősségét a kötőhelyeket allosztérikusan befolyásoló warfarin (3 - (3 - oxo - 1 - fenil - butil) - 4 - hidroxi - kumarin) adalékanyaggal megváltoztatjuk, a sztereoizomereket egymástól szétválasztjuk és az adalékanyagoktól megtisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a sztereoizomereket egymástól kromatografálással, ultraszűréssel, dialízissel, vagy centrifugálással választjuk szét. 5 10 15 20 25 30 35
