188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
188 709 kálium-klorid kobalt-klorid • 6 H20 vas-szulfát • 7 H20 glükóz .víz 2,0 g 0,004 g 0,04 g 15 g 1000 ml-re kiegészítve. 5 A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be, majd hozzáadjuk a glükózt a fermentor és a táptalaj sterilezését követően. Beoltjuk a tenyészetet a S. capillispira vegetatív tenyészetével, majd a fermen- 10 tációt 30 °C hőmérsékleten, keverés közben és a táptalajon át percenként 2,5 liter levegőt átvezetve kezdjük. A fermentációs elegy pH-ját 2 normál ammónium-hidroxid-oldat automatikus adagolásával 7,0 értéken tartjuk. 15 A 67. órában 5 liter/percre emeljük az átvezetett levegő mennyiségét, ezáltal a fölös mennyiségű ammóniagázt kilevegőztetjük. A habzás gátlására 6 ml szilikon habzásgátlót adagolunk. A fermentáció 91,5 órájában mintát veszünk, és 1 analizáljuk; a mintában ml-enként 3,28 mg száraz sejt található, a specifikus aktivitás 7,48 x 10“10 mól hidrolizált észter/perc x mg szárazsejt. Ez ekvivalens 2,5 x 10“5 mól hidrolizált észter/perc x liter fér- 25 mentié aktivitással. A 97. órában leállítjuk a fermentációt, a táptalajt szűrjük, amikor 510 g nedves sejtet kapunk. 8 g nedves sejtet 20 ml 8,0 pH-jú, 2 mmólos dikálium-hidrogén-foszfát-oldatlal hígítunk, ho- 30 mogenizáljuk a szuszpenziót, a sejteket ultrahanggal feltárjuk és centrifugáljuk. A felülúszó az ultraibolya analitikai módszer (Warburg és Christian, Biochem. Z., 310, 384-421, 1942) ml-enként 14,4 mg proteint tartalmaz. A metil - 7 - amino - 3 - metil 35 - 3 - cefem - 4 - karboxilát szubsztráttal szemben mért aktivitás: 2,2x 10“5 mól hidrolizált észter/ perc x liter. 120 g nedves sejtet 240 ml 2 mmólos, 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-oldattal hígítunk, kézi homogenizátorral homogenizáljuk a szuszpenziót. A homogenizátumot ultrahanggal feltárjuk, a feltárást 30 másodpercen át végezzük. A feltárást követően centrifugáljuk a szuszpenziót, a cenlrifugálást 45 30 percen át 0 °C hőmérsékleten 36 000 g-n végezzük. A 200 ml térfogatú felülúszót fagyasztva szárítva 3,76 g nyers enzimkészítményt kapunk. 1 g fagyasztva szárított port 15 ml, 2 mmólos, 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-oldalban szusz- 50 pendálunk, és az előzőekben ismertetett paraméterek mellett centrifugálunk. A 14 ml térfogatú felülúszót 2,5 cm x 8 cm méretű, keresztkötéseket tartalmazó allil-dextrán — metilén-bisz-akrilamid oszlopon kromatografáljuk (Sephacryl, Pharmacia 55 Fine Chemicals, Escataway, New Jersey). Az oszlopot a fagyasztva szárított por szuszpendálásakor használt pufferrel eluáljuk, egyenként 5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 200 ml-től a 250 ml-ig terjedő frakciókban mérjük az eszteráz-aklivitást. 60 Az eszterázt tartalmazó frakció fehérjetartalma 0,42 mg/ml és 1,13 mg/ml között változik, eszterázaktivitásuk 1 ' x 10'4- 1,9 x 10“6 mól hidrolizált észter/perc x lnv. A fermentléből nyert 34 g nedves sejtet, amit előzőleg dikálium-hidrogén-foszfát pufferral mostunk és fagyasztottunk, felolvasztunk, és 170 ml, 1,5 mmól ditio-treitolt tartalmazó 7,0 pH-jú, 1 mmólos dikáílium-hidrogén-foszfát pufferral hígítunk. Kézi homogenizátorral homogenizáljuk a szuszpenziót, majd 0 °C hőmérsékleten 20 percen át 36 000 g-n centrifugáljuk. A 140 ml térfogatú felülúszót analizáljuk, ml-enként 8,1 mg fehérjét tartalmaz. A korong-lemez-módszerrel mért aktivitása: 1,9 x 10~5 mól hidrolizált észter/perc x liter. Az enzim-oldatot ammónium-szulfátos' kicsapással tovább tisztítjuk. Úgy járunk el, hogy 31,2 g ammónium-szulfátot adunk a szuszpenzióhoz, addig keverjük, míg felolvad, majd 20 percen át 0 °C hőmérsékleten 36 000 g-n centrifugáljuk. Az üledéket kidobjuk, a felülúszóhoz további 30,6 g ammónium-szulfátot adagolunk, majd a fentiek szerint centrifugáljuk a szuszpenziót. A második centrifugálás után kapott üledéket 30 ml fenti összetételű pufferban oldjuk, az oldatot 4 liter, 1 mmólos, 7,2 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral szemben dializáljuk két alkalommal. Az oldat 7,5 mg/ml proteint tartalmaz. Tovább dializálva az oldatot, 65 ml térfogatú terméket kapunk, ezt fagyasztva tároljuk. 7,2 pH-jú vízben ml-enként 2 mg metil - 7 - (2 - amino - 2 - fenil) - acetil - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 - karboxilátot (mctil-cefalexint) oldunk. Az oldat 1,25 ml-éhez 3 ml fenti, tisztított enzimoldatot és 0,75 ml, 0,5 mólos dikálium-hidrogénfoszfát-puífert adunk, amikor olyan oldatot kapunk, amely 7,2 pH-jú és ml-enként 4,5 mg fehérjét tartalmaz. Az elegyet 30 °C hőmérsékleten 4 órán át rázzuk, majd papírkromatográfiát végzünk, és a kromatogramot Sarcina lutea mikroorganizmussal beoltott tápagar felületére helyezzük. A lemezen nagyméretű gátlási zónák látszanak, ami azt jelenti, hogy a cefalexin-észterről lehasadt az észtercsoport, és megkaptuk a cefalexin antibiotikumot. 16. példa 17. példa A példában a 16. példában megadottak szerint előállított enzim-készítményt használjuk, a metilcefalexin észterhasítására. A hidrolízis mértékét pH-sztát litrálással követjük. A reakcióelegyet a 16. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy 1 ml enzim-készítményt és 2 ml szubsztrát-oldatot használunk, így a reakcióelegy végül ml-enként 2,5 mg proteint tartalmaz. A reakciót pH 7-en és pH 8-on végezzük. pH 7-en az észterhasítás mértéke 4,0 x 10“6 mól/ perc x liter reakcióelegy, pH 8-on pedig 1,36 x 10“5 mól/perc x liter. 15
