188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 188 709 2 18. példa A 15. példában megadottak szerint előállított, és ml-enként 0,66 mg proteint tartalmazó, tisztított enzim-készítményt használjuk a meli! - 7 - (2 - amino - 2 - fenil) - acetil - amino - 3 - klór - 3 - cefem - 4 - karboxilát (metil-cefaklór) észterhasítására. A reakcióelegy előállítására 0,5 ml enzim-készítményt, 1,25 ml vizet és 0,25 ml, ml-enként 10 mg metil-cefaklórt tartalmazó oldatot keverünk össze. A reakciót pH 8-on 10 percen át végezzük 24 °C hőmérsékleten. A pH-sztát titrálás szerint a hidrolízis mértéke 5,8xl0~5 mól hidrolizált észter/perc x liter reakcióelegy. A keletkezett 7 - (2 - amino - 2 - fenil) - acetil - amino - 3 - klór - 3 - cefem - 4 - karbonsav UV maximuma pH = 7 púderban: UVma> = 265 nm (e = 6800). 19. példa 1 ml-enként 1,27 mg fehérjét tartalmazó, a 15. példában megadottak szerint Sephacryl-oszlopon tisztított enzim-készítményt használunk a metil-7- amino-3-metiI-3-cefem-4-karboxilát észterhasítására. Az enzim által katalizált reakciót különböző hőmérsékleteken, 15 °C-tól 35 °C-ig mérjük. A reakcióelegyet úgy állítjuk elő, hogy 0,4 ml enzim-oldatot, 0,6 ml vizet és 1 ml, 20 mg/ml koncentrációjú szubsztrát-oldatot keverjük. A reakcióelegy pH-ja 8,0. A reakciót olyan automatikus titrálóval végezzük, amely az enzim'távollétében megfelelően korrigálja a hidrolízis mértékét. A legmagasabb reakciósebesség 30 °C hőmérsékleten mérhető; ez 1,9 x 10-5 mól hidrolizált észter/perc x liter reakcióelegy. A legalacsonyabb reakciósebességet 15 °C hőmérsékleten mértük, ez 1,0 x 10~5 mól/ perc x liter. 35 °C hőmérsékleten az enzim nem stabil, észterhasítás gyakorlatilag nem mérhető. 20. példa A következő kísérletet a találmány szerinti észtéráz enzim szilárd fázishoz kötésére végezzük. A 15. példában megadottak szerint eljárva Sephacrylgyantán tisztítjuk az enzim-oldatot, a kapott készít mény ml-enként 0,75 mg proteint tartalmaz, aktivitása pedig 3,5 x 10~4 mól hidrolizált észter/perc x - liter. A készítmény 30 ml-ét Amicon ultraszürőn (Lexington, Mass.) PM 30 membránt használva szűrjük. A szűréskor az enzim oldalán emsénként 562 g nyomást biztosítunk nitrogénnel. Ahogy a szűrés folyik, vizet adunk mindaddig, mig 315 ml folyadékot gyűjtünk össze. A dializált enzimkészítmény végső térfogata 30 ml, a készítmény ml-enként 0,34 mg proteint tártál iaz, aktivitása pedig 7,2 x 10-5 mól hidrolizált és;.er/perc x liter. Az enzim szilárd fázishoz kötéséhez a következő anyagokat használjuk : 1. DEAE-Sephadex (dietilamino-etil, gyengén bázikus ioncserélő gyanta, Pharmacia Fine Chemicals). 2. DEAE-Sephacel (dietil-amino-eth cellulóz ioncserélő gyanta, Pharmacia Fine Chem'cals). 3. DEAE-cellulóz, Sigma Chemical Ce St. Louis, Mo., USA. 4. Cellex-CM, Bio-Rad Laborato ’es, Richmond, California, USA. 5. Bentonit. 6. DEAE-Cellulóz, ezt Tsao és Che r által közreadott 4 063 017 számú amerikai szabadalmi leírás szerint állítottuk elő. 1,5 mg (szárazsúly) fenti anyagot 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral mosunk, majd a mosást vízzel megismételjük. Ezután 3,53 ml enzim-készítménnyel keverjük, a készítmény pH-ját keverés előtt 8,0-ra állítjuk be. A keveréket 18 órán át 4 °C hőmérsékleten enyhén keverjük. Mindegyik szilárd fázishoz kötött enzim-készítményt 7,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral mosunk a nem-kötött enzim eltávolítására. A mosófolyadékokat és a mosott, szilárd fázisú enzim-készítményt a szilárd fázishoz kötődő enzim mennyiségének meghatározására metil-7-amino-3- metil-4-karboxiláttal reagáltatunk. Az analízis szerint a következő mennyiségű enzim kötődött a szilárd fázishoz: 1. 24 % 2. 33 % 3. 34 % 4. 8 3 5. 6 % 6. 40 %. A szilárd fázishoz kötött enzim-készítményt 40 °C hőmérsékleten tartjuk, és az enzim felezési idejének meghatározására időnként analizáljuk. A következő eredményeket kapjuk: Szilárd fázishoz nem kötött enzim 5 perc 1. 4 perc 2. 3,5 perc 3. 5,5 perc 4. az alacsony'aktivitás miatt nem mérhető 5. az alacsony aktivitás miatt nem mérhető 6. 13 perc. 21. példa A 17. példában leírtak szerint eljárva 7 - [D - a - (4 - hidroxi - fenil) - acetil - amino] - 3 - metil - 3 - cefem - 4 - karbonsav - metil - észtert észterhasításnak alávetve a megfelelő szabad savat kapunk. A termék olvadáspontja 197 °C (bomlás közben). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
