188700. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-dezoxinojirimicin N-szubsztituált-származékainak az előállítására
188 700 mok csoportjába tartozó baktériumok is, különösen a Corynebacterium fajba tartozó baktériumok. Az oxidáció végrehajtható gombákkal, például az Endomycetales rendbe tartozó élesztőkkel, különösen a Spermophthoraceae család és ezen belül főként a Metschnikowia faj képviselő- 5 ivei is. Példaként megnevezzük a következőket: Gluconobacteroxidans spp. suboxydans (DSM 50 049), Glutobacteroxidans spp. suboxydans (DSM 2003), Corynebacterium betae (DSM 20 141) és Metschnikowia pulcherrima 10 (ATCC20 515). A DSM-számok azt a számot jelölik, amely alatt a megadott mikroorganizmusokat a „ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen” -nél letétbe helyezték. A Metschnikowia pulcherrima az „American Type Culture Collecti- 15 on”—nál (Rockwille Maryland, Amerikai Egyesült Államok) került letétbehelyezésre. Ha az oxidációt növekvő tenyészetben intakt mikroorganizmusokkal végezzük, akkor szilárd, félszilárd vagy folyékony táptalajokat alkalmazhatunk. Előnyösen 20 vizes folyékony táptalajokat alkalmazunk. A tenyésztést minden olyan táptalajban végezhetjük, amely a megadott csoportokba tartozó mikroorganizmusok tenyésztéséhez ismert módon alkalmazható, és amely tartalmazza az oxidálandó vegyülctet. A táptalaj- 25 nak asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint ásványi sókat kell tartalmaznia. Asszimilálható szén és nitrogénforrásként mindenekelőtt komplex keverékek, mint különösen különböző eredetű biológiai termékek — alkalmazhatók. Ilyenek például a szójababliszt, a gyapotmag- 30 liszt, a lencseliszt, a borsóliszt az oldható és oldhatatlan növényi proteinek, a kukoricalekvár, az élesztőkivonat, a pepton és a luiskivonat. A nitrogén források lehetnek ezen kívül ammóniumsók és nitrátok, például ammonium-klorid, ammonium—szulfát, nátrium—nitrát és kálium-nit- 35 rát. A táptalaiban alkalmazható ásvánvi sók például Mg++, Na+, K+, Ca”, NI l.,+, Cl~, SO/’, PO., és N03 “ionokat, ' ezen kívül a szokásos nyomelemeknek az ionjait, mint Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co és Ni fémek ionjait tartalmazzák. Ha a megadott komplex táptalajkomponensek- 40 ben vagy az alkalmazott vízben ezek a sók, illetve nyomelemek nincsenek elég nagy mennyiségben jelen, akkor célszerű ezekkel a táptalajt kiegészíteni. Azt tapasztaltuk, hogy a közbenső anyagcscrefo- • lyamat vegyültteirtek és inás sejt -építőelemeknek, példa- 45 ul aminosavaknak vagy trikarbonsavcildus vegyületeinek a táptalajhoz való adagolása lényegesen lerövidíti az átalakulást. Az oxidálandó vegyülctet adagolhatjuk egymagában vagy más oxidálandó vcgyülcttel együtt az alap-táp- 50 talajhoz. Ilyen egyéb oxidálandó vegyiiletek lehetnek a primer alkoholok — páldául az etanol—, a szekunder al- ' koholok — például az izopropanol—, a poliolok - például a szorbit vagy glicerin-, az aldehidek- például a glikolaldehid-, az áldozok - például a glükóz - és a glükonsavak Amennyiben az említett vegyületek közül egyet vagy többet hozzáadunk a tápoldathoz, úgy az oxidálandó vegyületet vagy a beoltás előtt vagy később — egy előző nyugvó—fázis és egy későbbi stacioner növekedési—fázis go közötti tetszés szerinti időpontban — adagoljuk. Ebben az esetben az alkalmazott organizmust az alkalmazott oxidálandó vegyületen elő tény észtjük. Az oxidációt 2—10, előnyösen 4-8 pH-tartományban folytatjuk le. A tenyészetet a megadott pH—tar- 65 tomanyban előnyösen például foszfát— vagy acetát-pufferrel pufferoljuk. A fermentációs technológiában ismert módon a pH-értéket automatikusan is szabályozhatjuk. Ilyenkor a tápoldatba meghatározott időközönként steril szerves vagy szervetlen savakat - vagy steril bázisokat — például nátrium—hidroxidot — viszünk be. Mint a mikrobiológiai eljárásokban általában, a talál nány szerint is el kell kerülni a táptalajnak idegen anyagokkal való fertőzöttsegét. E célból például a táptalajt, a tenyésztéshez alkalmazott edényt, valamint a levegőztítéshez alkalmazott levegőt sterilizáljuk. Az edények sterilizálásához például gőz- vagy száraz-sterilizálás alkalmazható. A levegőt és a táptalajt szintén gőzzel, ezen kívül szűréssel sterilizálhatjuk. A táptalajt általánosan ismert módon oltjuk be, például ferde agaron vagy lombikban tenyésztett tenyészetekkel. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük ismert módon, rázott tenyészetekkel - például rázott lombikban —, levegőztetett tenyészetekkel. A tenyésztést előnyösen levegőztetett fermentátorokban aerob szubmer/. eljárásban — például ismert szubmerz fermentációs tartályokban - folytatjuk le. A tenyésztést végezhetjük folyamatosan vagy szakaszosan. Előnyösen szakaszosan dolgozunk. Célszerű biztosítanunk, hogy a mikroorganizmusok megfelelően érintkezzenek az oxigénnel és a tápanyagokkal. Ezt például ismert módon rázással vagy keveréssel érjük el. Ha a tenyésztés során nemkívánt mennyiségű hab keletkezik, akkor ismert kémiai habzásgátló szereket - például folyékony zsírokat és olajokat, olaj/víz emulziókat, paraffinokat, nagy szénatomszámú alkoholokat, szilikoiiolajat, polioxictilén — vagy polioxipropilén—származékokat — adagolunk. A habzás mértékét ismert mechanikai eszközökkel is csökkenthetjük vagy megszüntethetjük. A tenyésztés hőmérséklet mintegy 20-45°C. A tenyésztés időtartama széles tartományban változhat, meghatározásában a táptalaj összetételének és a tenyész-' tési hőmérsékletnek van fontos szerepe. A mindenkori optimális körülményeket a mikrobiológia területén jártas szakember könnyen meg tudja határozni. Megállapítottuk, hogy a tápoldathoz hozzáadott oxidálandó vegyület teljes átalakulásához az adaglást követően általában 3 óra és 7 nap közötti inkubációs idő szükséges. Az oxidációs reakciót végrehajthatjuk a megfelelő mikroorganizmus tömény sejtszuszpenziójával is. A tömény sejtszuszpenziót a következők szerint állítjuk elő: A kiválasztott mikroorganizmust megfelelő táptalajban tenyésztjük, majd például centrifugálással összegyűjtjük és az ilkalmazott tápoldat kisebb mennyiségben vagy só'vagy pufferoldatban — például fiziológiai konyhasó—oldatban, kálium—dihidrogén-foszfát vizes oldatában, nátrium-acetát vizes oldatában, nátriuin-maleinát vizes oldatában vagy egyszerűen csapvízben vagy desztillált vízben —szuszpendáljuk. Az így előállított sejtszuszpenzióhoz ezután hozzáadjuk az oxidálandó vegyületet, és az oxidációi reakciót a növekvő tenyészetekre megadott körülmények között folytatjuk le. Az eljárás előnye, hogy nagyobb mikroorganizmus-koncentráció következtében az oxidációs reakció időtartama néhány órára csökken le. 3
